郭俊剛，高玉平，馬維娜

（上海健康醫(yī)學(xué)院附屬嘉定區(qū)中心醫(yī)院，上海 201800）

目前，血塞通注射液單用或與西藥聯(lián)用已在臨床廣泛使用，其中三七總皂苷是血塞通注射液的主要有效成分。三七總皂苷具有消腫止痛、活血散瘀等作用［1-2］，是一種非特異性鈣通道阻滯劑，能有效抑制平滑肌收縮，發(fā)揮擴(kuò)張血管、降低動(dòng)脈血壓、降低血黏度、改善血液流變學(xué)、抗動(dòng)脈粥樣硬化等作用［2-3］。細(xì)胞色素 P450（CYP450）同工酶參與各種外源性物質(zhì)包括治療藥物和一些內(nèi)源性物質(zhì)的代謝，是重要的藥物代謝酶類，受遺傳、機(jī)體、年齡、營養(yǎng)狀態(tài)、疾病等多種因素的影響，常見亞型如 CYP1A2，CYP2C9，CYP2D6，CYP3A4，參與大約90%的藥物代謝［4］。CYP450酶在藥物代謝中的作用對臨床合理用藥及實(shí)施個(gè)體化給藥方案和避免藥品不良反應(yīng)都有重要意義［5］。中藥的成分比較復(fù)雜，其有效成分或單體在體內(nèi)同樣需要通過CYP450酶系進(jìn)行代謝，也會(huì)對其活性產(chǎn)生抑制或誘導(dǎo)作用，導(dǎo)致聯(lián)合用藥后藥物在體內(nèi)的代謝發(fā)生變化［6］。本研究中通過培養(yǎng)Chang Liver細(xì)胞，檢測三七總皂苷對CYP3A4和CYP2C9 mRNA及蛋白表達(dá)的影響，明確其作用機(jī)制，為臨床合理使用提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 儀器、試藥與細(xì)胞

儀器：WFH-203B型低溫高速離心機(jī)（美國Beckman CouLter公司）；CI-160-A型恒溫 CO2培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；biorad免疫印跡電泳轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio RAD公司）；biotek酶標(biāo)儀（美國 Bio Tek公司），ND2000型超微量分光光度計(jì)（美國Nanodrop公司）；凝膠圖像分析系統(tǒng)（法國ViLber公司）。

試藥：三七總皂苷（上海一飛生物科技有限公司，批號為 F657123，純度＞98%）；CCK-8試劑盒（日本Dojindo公司，批號為 KTC011001）；CYP3A4抗體（美國Santa Cruz公司，批號為 AY-11209R）；CYP2C9 抗體（英國 Abcam公司，批號為 hz-20243R）；胰蛋白酶（GIBCO 公司，批號為 RPT0201）；Trizol試劑（美國Invitrogen公司，批號為 15596026）；RT-PCR試劑盒（日本TaKaRa公司，批號為E5310S）；10%胎牛血清（浙江天杭生物科技有限公司，F(xiàn)BS，批號為201406）；青-鏈霉素（MiLLpore 公 司 ，批號為 PS2004HY）；高糖DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司，批號為11995-065），蛋白定量試劑盒（碧云天生物公司，批號為34090163）；辣根過氧化酶標(biāo)記的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（HRPGAPDH，上?？党缮锕こ坦?，批號為16274R）。

細(xì)胞：Chang Liver細(xì)胞（上海中科院細(xì)胞研究所，編號為 C0222）。

1.2 方法

細(xì)胞系及培養(yǎng)：Chang Liver細(xì)胞在37℃及5%CO2培養(yǎng)箱中，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，1% 雙抗（青霉素 100 kU ／L，鏈霉素 100 kU ／L）培養(yǎng)，2～3 d換1次培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)70% ～80%時(shí)用0.4%胰酶消化，取對數(shù)生長期的細(xì)胞。

CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率：將Chang Liver細(xì)胞制成1×105個(gè)／mL的單細(xì)胞懸液，每孔180 μL加入96孔培養(yǎng)板中，置37℃及5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組分別加入6個(gè)不同濃度的三七總皂苷96孔板內(nèi)，每孔加藥量 20 μL，藥物終質(zhì)量濃度為 6.25，12.50，25.00，50.00，100.00，200.00 μg ／mL；對照組加等量DMEM培養(yǎng)基，每種劑量設(shè)置5個(gè)平行孔。在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，吸去上清液，用磷酸緩沖溶液（PBS）漂洗 2 次，再加入 200 μL 培養(yǎng)基，每孔加入CCK-8 溶液 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 2 h，取上清液 50 μL，于自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀（490 nm）測定各孔吸光度（A），計(jì)算抑制率。抑制率（IR）＝［（A對照組-A實(shí)驗(yàn)組）／A對照組］×100%。

RT-PCR法檢測相關(guān)mRNA表達(dá)：采用RT-PCR方法檢測三七總皂苷對Chang Liver細(xì)胞中CYP3A4和CYP2C9基因表達(dá)的影響。Chang Liver細(xì)胞接種于6孔板中，接種細(xì)胞密度為1×105個(gè)／mL，在 37℃及5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞單層貼壁生長至70%左右時(shí)，根據(jù)藥物CCK-8的結(jié)果，加入100 μg／mL三七總皂苷分別干預(yù) 4，8，24，48 h。培養(yǎng)結(jié)束后，從細(xì)胞培養(yǎng)板上吸走培養(yǎng)液，加1 mL PBS清洗1次，加入1 mL TRIzol，將細(xì)胞從培養(yǎng)板上刮下來吹打，混勻，轉(zhuǎn)移至干凈的 1.5 mLEP 管中，加入 200 μL氯仿，搖晃，混勻，使體系成粉紅色乳濁狀，以12 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心15 min，移取上清液至新的1.5 mL EP管中，加入600 μL異丙醇，充分混勻，-20℃助沉45 min后，以12 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心15 min；棄上清液，加入1 mL冰 75%RNA專用乙醇，輕彈管底使沉淀懸浮，以 12 000 r／min的轉(zhuǎn)速離心10 min，室溫下靜置10～15 min，使RNA適度干燥，用不含Rnase去離子水溶解，取2 μL測定濃度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，再以cDNA作為RT-PCR的反應(yīng)模板，之后配制反應(yīng)液進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。目的基因CYP3A4和CYP2C9擴(kuò)增程序如下：95 ℃預(yù)變性 3 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃1 min，循環(huán)40次，測定融解曲線，最后通過ct值計(jì)算mRNA相對表達(dá)量。

蛋白質(zhì)印跡（Western Blot）法檢測蛋白表達(dá)：取處于對數(shù)生長期的Chang Liver細(xì)胞接種于24孔板中，置5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，加入 100 μg ／mL 三七總皂苷，分別干預(yù) 4，8，24，48 h，24 孔板長滿細(xì)胞后，吸去培養(yǎng)基，加 1 mL冰預(yù)冷 PBS（pH ＝7.4）洗 1次，吸去PBS，加入細(xì)胞裂解液（RIPA 強(qiáng)裂解液）450 μL，加入蛋白酶抑制劑，低溫環(huán)境下均勻搖晃30 min使細(xì)胞充分裂解。待細(xì)胞充分裂解后，將所有細(xì)胞加入裂解液中，轉(zhuǎn)移至5 mL試管中超聲處理4 s，向1.5 mL進(jìn)口離心管中加入1／4體積的5X Loading buffer，金屬浴100℃煮10 min。室溫冷卻至4℃，保存樣品。配制3.9% 濃縮膠、10% 分離膠。濃縮膠用80 V電壓電泳約70 min，之后轉(zhuǎn)膜120 min，TBST緩沖液封閉1 h。繼續(xù)加入一抗［GAPDH（1 ∶1000），CYP2C9（1∶1000），CYP3A4（1∶200）］，4℃搖床孵育過夜。過夜后的TBST緩沖液洗膜3次，加入稀釋2 000倍的二抗，室溫放置1 h，TBST緩沖液洗膜后化學(xué)發(fā)光試劑顯色發(fā)光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SAS 9.3統(tǒng)計(jì)軟件處理。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，多組間比較采用方差分析，組間平均值比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 對細(xì)胞株的抑制作用結(jié)果見圖 1。不同質(zhì)量濃度三七總皂苷（6.25，

12.50，2 5.00，50.00，100.00，200.00 μg ／mL）對 Chang Liver細(xì)胞均有不同程度的抑制作用，抑制率大小呈濃度依賴性。Western Blot法及RT-PCR試驗(yàn)中所選取三七總皂苷的濃度為 100 μg／mL。

圖1 三七總皂苷對Chang Liver細(xì)胞的抑制作用

2.2 對CYP3A4和CYP2C9蛋白表達(dá)的影響

結(jié)果見表1、圖2至圖4?？梢姡呖傇碥諏hang Liver細(xì)胞是一種誘導(dǎo)作用。各組CYP2C9的蛋白表達(dá)量與空白對照組相比，差異均有顯著性（P＜0.05），且隨著作用時(shí)間的延長，各組誘導(dǎo)水平也相應(yīng)增加。8 h組、24 h組、48 h組CYP3C4蛋白表達(dá)量與空白對照組相比，差異均有顯著性（P＜0.05），但4 h組與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），各組相對蛋白表達(dá)量同樣呈時(shí)間依賴性。

表1 三七總皂苷對CYP3A4和CYP2C9蛋白及mRNA表達(dá)的影響（相對表達(dá)量，±s）

表1 三七總皂苷對CYP3A4和CYP2C9蛋白及mRNA表達(dá)的影響（相對表達(dá)量，±s）

蛋白表達(dá) mRNA組別空白對照組干預(yù) 4 h組8 h組24 h組48 h組CYP3A4 0.19 ±0.02 0.34 ±0.03 0.53 ±0.06 0.67 ±0.07 0.86 ±0.08 CYP2C9 0.18 ± 0.03 0.68 ± 0.06 0.93 ± 0.08 1.03 ± 0.12 1.11 ± 0.09 CYP3A4 0.63 ± 0.07 0.95 ± 0.09 1.21 ± 0.06 1.33 ± 0.07 1.64 ± 0.09 CYP2C9 0.59 ±0.06 0.92 ±0.09 1.19 ±0.08 1.27 ±0.12 1.84 ±0.14

圖2 三七總皂苷對Chang Liver細(xì)胞中CYP2C9及CYP3A4蛋白表達(dá)的影響

圖3 不同時(shí)間三七總皂苷對CYP2C9蛋白的影響

圖4 不同時(shí)間三七總皂苷對CYP3A4蛋白的影響

2.3 對CYP3A4和CYP2C9 mRNA表達(dá)的影響

結(jié)果見表1、圖5至圖7。結(jié)果顯示，三七總皂苷對Chang Liver細(xì)胞是一種誘導(dǎo)作用。4 h組的 CYP2C9 mRNA表達(dá)量與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），8 h組、24 h組、48 h組的mRNA表達(dá)量與空白對照組相比均有顯著差異（P＜0.05），且隨著作用時(shí)間的延長，各組的誘導(dǎo)水平也相應(yīng)增加。4 h組的CYP3A4 mRNA表達(dá)量與空白對照組相比無顯著差異（P＞0.05），8 h組、24 h組、48 h組的mRNA表達(dá)量與空白對照組相比均有顯著差異（P＜0.05），且隨著作用時(shí)間的延長，誘導(dǎo)水平也相應(yīng)增加。

圖5 三七總皂苷對Chang Liver細(xì)胞中CYP2C9及CYP3A4 mRNA表達(dá)的影響

3 討論

三七是一種多年生草本植物，三七總皂苷中三七皂苷 R1、人參皂苷 Rg1、Rb1、Rd和 Re為其主要成分，約占總皂苷含量的80%［7］。三七中皂苷在抗缺氧、抗衰老，及提高人體免疫力方面都具有明顯優(yōu)勢，臨床常用于心腦系統(tǒng)、血液系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)及物質(zhì)代謝等方面疾病的治療［8-9］。三七總皂苷對P450酶的表達(dá)有一定影響，可進(jìn)一步影響其他藥物在體內(nèi)的代謝。CYP450酶中最重要的一個(gè)亞型是CYP3A4，臨床約60%的常用藥物由CYP3A4代謝［10］，其主要在肝臟和小腸中表達(dá)，并參與免疫抑制劑、降血糖藥、抗生素、抗腫瘤藥物等多種藥物的代謝［11］。陳艷進(jìn)等［12］研究表明，三七總皂苷對CYP3A4酶的活性水平無明顯作用，但對mRNA表達(dá)水平有明顯的誘導(dǎo)作用（P＜0.05），這可能是在轉(zhuǎn)錄過程中出現(xiàn)了抑制，導(dǎo)致酶活性水平無明顯作用。CYP1A占整個(gè)細(xì)胞色素P450酶系的13% ～15%，參與了約5%上市藥物的代謝，主要分布于肝臟中，另外在腸道、腦、肺等組織中也有少量分布，主要參與多環(huán)芳烴和芳香胺類化合物的代謝［13］。LIU 等［14］的研究闡明了三七總皂苷對大鼠CYP1A2的誘導(dǎo)作用，通過Western Blot法證實(shí)了使用三七總皂苷后肝臟中CYP1A2蛋白表達(dá)上調(diào)。通過研究CYP1A2的專屬探針?biāo)幬锟Х纫?、氨苯砜的體外代謝變化，并評價(jià)血塞通對CYP1A2的作用［15］，發(fā)現(xiàn)血塞通組探針?biāo)幬锟Х纫蝮w外半衰期為（9.24±2.37）min，明顯短于對照組的（25.15 ±2.02）min（P＜ 0.05），說明血塞通對CYP1A2有誘導(dǎo)作用。

圖6 不同時(shí)間三七總皂苷對CYP2C9 mRNA的影響

圖7 不同時(shí)間三七總皂苷對CYP3A4 mRNA的影響

本研究中選取目前用于藥物研究中與原代培養(yǎng)肝細(xì)胞特性最接近的Chang Liver細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株，結(jié)果表明，100 μg／mL三七總皂苷干預(yù) Chang Liver細(xì)胞 4，8，24，48 h 后，CYP3A4 和 CYP2C9 蛋白表達(dá)及mRNA表達(dá)與空白對照組相比均有不同程度的升高，且呈時(shí)間依賴性，提示三七總皂苷對CYP3A4和CYP2C9是一種誘導(dǎo)作用。前期研究中以三七總皂苷為主要成分的血塞通與氯沙坦鉀聯(lián)合使用后大鼠體內(nèi)氯沙坦鉀及其活性代謝產(chǎn)物EXP3174的血藥濃度，結(jié)果顯示，聯(lián)合用藥后氯沙坦鉀的半衰期縮短和表觀分布容積顯著降低（P＜ 0.05），達(dá)峰時(shí)間顯著延長（P＜ 0.05），代謝物EXP3174的半衰期顯著縮短（P＜0.05），達(dá)峰時(shí)間顯著延長（P＜0.05）。半衰期縮短，說明氯沙坦鉀與血塞通聯(lián)用后，縮短了藥物在體內(nèi)發(fā)揮藥效的時(shí)間，誘導(dǎo)其代謝；達(dá)峰時(shí)間縮短，說明原型產(chǎn)物在體內(nèi)減少，血塞通對氯沙坦鉀起到了一定的誘導(dǎo)作用［16］。與本研究結(jié)果一致，即三七總皂苷能誘導(dǎo)CYP2C9及CYP3A4酶的活性，并加快氯沙坦鉀在體內(nèi)的代謝，因此2種藥物在聯(lián)用時(shí)可能需要調(diào)整給藥間隔及給藥次數(shù)。WANG等［17］同樣考察過丹參片和氯沙坦鉀在SD大鼠體內(nèi)聯(lián)合用藥后，氯沙坦鉀和活性代謝產(chǎn)物EXP3174的藥代動(dòng)力學(xué)變化及丹參片的活性成分對CYP450酶的影響，結(jié)果表明，丹參片中的丹酚酸B及丹參酮ⅡA可能是通過誘導(dǎo)CYP3A4和CYP2C9酶的活性而加快原型藥物氯沙坦鉀在大鼠體內(nèi)的代謝，提示丹參片和氯沙坦鉀聯(lián)用后可能會(huì)產(chǎn)生相互作用。

綜上所述，三七總皂苷作為臨床常見藥物血塞通及血栓通的活性成分，具有多種藥理活性，在我國可能通過影響CYP450酶的活性而與其他藥物發(fā)生相互作用，臨床需要更加關(guān)注用藥劑量的調(diào)整及不良反應(yīng)。