宋國(guó)紅，李 卿，尹小玲

（1.重慶市中藥研究院，重慶 400065； 2.重慶三峽中心醫(yī)院，重慶 404000）

益陰消渴原劑型為膠囊劑，功能主治為益氣養(yǎng)陰、清熱生津，用于氣陰不足所致消渴及2型糖尿病見上述證候者。由于原制劑中有效成分葛根素在水中溶解度較差，口服后吸收緩慢，選用的普通膠囊制劑采用部分藥物粉碎后直接入藥的方式，影響其臨床療效的發(fā)揮和患者的順應(yīng)性。本研究中采用先進(jìn)提取純化技術(shù)，提取分離益陰消渴處方中有效成分，提高有效成分含量，采用固體分散技術(shù)研制成現(xiàn)代速釋制劑，既能降低血糖，又能改善糖尿病癥狀，減少糖尿病并發(fā)癥，保護(hù)糖尿病受損靶器官，劑型先進(jìn)，釋藥速度快，生物利用度高。本研究中采用L9（34）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)，以處方中君藥葛根的主要成分葛根素為測(cè)評(píng)指標(biāo)，優(yōu)化益陰消渴方的提取工藝，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

儀器：LC-2010A型高效液相色譜儀（日本島津公司）；SB-5200D型超聲波清洗機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；HH-S型水浴鍋（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；AE240型電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）。

試藥：葛根、野苦瓜、荔枝核、山藥藥材均購(gòu)自重慶市菜園壩中藥材市場(chǎng)，經(jīng)重慶市中藥研究院肖銘玉副研究員分別鑒定為豆科植物野葛Pueraria lobata（Willd.）ohwi的干燥根，葫蘆科植物野苦瓜Momordica charantiaL.的成熟果，無患子科植物荔枝Litchi chinensisSonn.的干燥成熟種子，薯蕷科植物薯蕷Dioscorea oppositeThunb.的干燥根莖；葛根素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，供含量測(cè)定用，批號(hào)為752-200108）；甲醇為色譜純，水為一級(jí)水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 葛根素含量測(cè)定

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)［1］

色譜柱：Diamonsil C18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -水（28 ∶72）；流速：1 mL ／min；柱溫：30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。在此條件下的色譜圖見圖1。葛根素色譜峰與相鄰峰分離度良好。

2.1.2 溶液制備

取葛根素對(duì)照品18.64 mg，精密稱定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻，作為對(duì)照品貯備溶液。照樣品處方比例，取野苦瓜2.5 g，葛根15.5 g，荔枝核1.0 g，山藥1.0 g，共9份，按正交試驗(yàn)方案回流提取，濾過，濃縮至適量，用乙醇定容至250 mL，搖勻；精密量取2.0 mL，置10 mL容量瓶中，加甲醇適量，超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為50 kHz）15 min，冷至室溫，用甲醇定容至刻度，搖勻，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。照樣品處方比例，稱取缺葛根的其余3味藥材，照供試品溶液制備方法制備缺葛根陰性對(duì)照品溶液。

圖1 高效液相色譜圖

2.1.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密吸取葛根素對(duì)照品貯備溶液 0.5，1.0，2.0，4.0，5.0 mL，置 10 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻。精密量取10 μL，進(jìn)樣，按擬訂色譜條件測(cè)定，以葛根素進(jìn)樣量（X，g）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y＝7131295X-34632，r＝0.9999（n＝5）。結(jié)果表明，葛根素進(jìn)樣量在 0.3728 ～3.728 0 g范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μL，在擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定。結(jié)果的RSD為0.78%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一供試品溶液，分別于0，1，4，8，16 h時(shí)進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果峰面積值的RSD為0.94%（n＝6），表明供試品溶液在16 h內(nèi)較穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取制備的同一樣品6份，照2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，按擬訂色譜條件，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量。結(jié)果的RSD為1.06%（n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取同一樣品6份，精密加入葛根素對(duì)照品適量，照2.1.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測(cè)定含量，計(jì)算回收率。結(jié)果見表1。

表1 葛根素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.2 提取試驗(yàn)單因素考察

以乙醇為提取溶劑，采用回流法進(jìn)行提取，以葛根素的含量為考察指標(biāo)，設(shè)置單因素試驗(yàn)分別考察料液比、提取時(shí)間和提取次數(shù)對(duì)葛根素的影響。

料液比：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入4，6，8，10，12 倍量 65% 乙醇，提取 2 次，每次 60 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至 250 ml，搖勻。照 2.1.2 項(xiàng)下供試品溶液制備方法中“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。

提取時(shí)間：按處方比例，稱取5份樣品，分別加入10倍量 65% 乙醇，提取 2 次，時(shí)間為 30，40，60，70，80 min，濾過，合并濾液，加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。

提取次數(shù)：稱取5份樣品，加入10倍量65%乙醇，分別提取 1，2，3，4 次，時(shí)間為 60 min，濾過，濾液加乙醇定容至250 mL，搖勻。照2.1.2項(xiàng)下供試品溶液制備“精密量取2.0 mL”起，制備供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定。

試驗(yàn)結(jié)果：隨著料液比的增加，葛根素含量增加，在8倍量時(shí)達(dá)最大值，再增大提取溶劑用量，含量不再增加。因此提取溶劑的用量以6，8，10倍量作為正交試驗(yàn)料液比的3個(gè)水平；回流提取時(shí)間試驗(yàn)結(jié)果表明，試驗(yàn)前段隨著提取時(shí)間的增加，葛根素含量增加，60 min后葛根素含量趨于穩(wěn)定，故選擇回流50，60，90 min作為正交試驗(yàn)提取時(shí)間的3個(gè)水平；提取次數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明，葛根素含量在提取2次后維持在相對(duì)平穩(wěn)狀態(tài)，故選擇1，2，3次作為正交試驗(yàn)提取次數(shù)的3個(gè)水平。

2.3 提取工藝優(yōu)化

正交試驗(yàn)：以提取液中的葛根素為考察指標(biāo)，因素A為乙醇濃度，因素B為溶劑用量，因素C為提取時(shí)間，因素D為提取次數(shù)，采用L9（34）正交試驗(yàn)進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果見表2和表3?？梢?，影響提取效果的因素順序?yàn)镈＞A＞C＞B，以D3A3C3B2組合最佳。因素A與因素D影響較大，因素C與因素B影響較小，故從節(jié)能、低成本考慮，生產(chǎn)中采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5h，第2，3次回流1 h。

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證優(yōu)選工藝的合理性，根據(jù)擬訂提取方法，稱取野苦瓜20 g，葛根124 g，荔枝核8 g，山藥8 g，共3份，采用70%乙醇提取3次，乙醇用量為藥材量的6倍，第1次回流1.5 h，第2次、第3次回流1 h，濾過，合并濾液，回收乙醇，并用乙醇定容至適量，測(cè)得葛根素含量分別為 0.846%，0.851%，0.848%，RSD為 0.30% （n＝3）。表明益陰消渴滴丸新的提取工藝能達(dá)到提取要求，符合實(shí)際生產(chǎn)需要，提取工藝條件穩(wěn)定可行。

表2 正交試驗(yàn)因素水平及結(jié)果（n＝9）

表3 方差分析

3 討論

本試驗(yàn)中通過影響提取效率的單因素考察與正交試驗(yàn)相結(jié)合的方式，優(yōu)化了益陰消渴方的初步提取工藝，為后續(xù)分離純化提供了數(shù)據(jù)分析基礎(chǔ)。篩選優(yōu)化工藝參數(shù)時(shí)，不僅考慮了葛根素的提取率，且充分注重提取方法在工業(yè)化大生產(chǎn)中的實(shí)際應(yīng)用，即生產(chǎn)成本，人力、物力消耗，溶劑損耗，提取周期的設(shè)置等，節(jié)省各項(xiàng)生產(chǎn)中消耗支出，極大地增強(qiáng)了企業(yè)的產(chǎn)品競(jìng)爭(zhēng)力。

參考文獻(xiàn)［2-10］，葛根含多種化學(xué)成分，包括黃酮類、三萜類、甾體類、香豆素類，其提取方法有乙醇回流提取法、乙醇超聲提取法、微波法、超臨界提取法、水煎煮提取法等；野苦瓜主要化學(xué)成分包括三萜、甾類、生物堿；荔枝核含皂苷；山藥含游離氨基酸，尿囊素，膽堿，麥角甾醇等，以上各藥所含主要有效成分在水和乙醇中均能較好地溶解。前期預(yù)試中，對(duì)處方中藥材的提取方法進(jìn)行了初步篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以葛根素為代表的檢測(cè)指標(biāo)采用水煎煮法進(jìn)行制備，其含量為0.65%；采用乙醇回流法進(jìn)行提取，葛根素含量為0.82%。2種提取方法差異明顯，故本研究選用乙醇回流法進(jìn)行制備工藝優(yōu)化。

采用正交試驗(yàn)優(yōu)化中藥類產(chǎn)品提取工藝時(shí)，多采用含量檢測(cè)結(jié)合浸膏收率的多指標(biāo)試驗(yàn)優(yōu)選工藝參數(shù)，由于浸膏收率不但不能突出表明該工藝的優(yōu)越性，各項(xiàng)影響因素及水平對(duì)浸膏收率的影響不盡相同，反而可能阻礙其含量檢測(cè)指標(biāo)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析和判斷。而本試驗(yàn)中制備高效富集處方的有效部位群要為下一步純化提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，故未選擇浸膏收率作為該優(yōu)化提取工藝參數(shù)的指標(biāo)。益陰消渴原制劑為部分葛根藥材粉碎入藥，葛根中主要成分葛根素溶出較慢［11-14］，在人體內(nèi)吸收和利用較差。本試驗(yàn)中選用乙醇回流提取法進(jìn)行制備，野苦瓜、葛根等有效成分相當(dāng)部分都能從藥材中提取，再經(jīng)大孔樹脂富集、純化，中間固形物收率減少，日服用量降低，利用固體分散技術(shù)制成滴丸劑，藥物中有效成分溶出速度加快，生物利用度提高。