林蕓蕓，顧申紅△，宋艷玲，蔡海云，譚 琰

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，海南 ?？?570000；2.海南醫(yī)學(xué)院第一臨床學(xué)院，海南 ?？?570000）

麥冬Ophiopogon japonicus（Linn.f.）Ker-Gawl.有生津解渴、潤肺止咳之功效［1］，有明顯的抗心肌缺血功效，化學(xué)成分含麥冬皂苷 A，B，B′，C，C′，D，D′等［2-3］。麥冬皂苷D（OPD）可通過調(diào)控細胞鈣通道穩(wěn)態(tài)，從而抑制氧化應(yīng)激，減少心肌細胞凋亡［4］；還可通過抗氧作用抑制阿霉素誘導(dǎo)的心肌自噬性損傷，發(fā)揮保護效應(yīng)［5］。麥冬皂苷D′（OPD′）與OPD結(jié)構(gòu)十分相似，然而至今對OPD′的藥物毒理研究很少。本研究中探討了OPD′對心肌細胞H9c2細胞的細胞毒性作用?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 細胞、儀器與試藥

細胞株：大鼠心肌細胞H9c2購自美國模式培養(yǎng)物保藏中心 （ATCC CRL-1446）。

儀器：c150型CO2細胞培養(yǎng)箱（德國Binde公司）；SW-CJ型超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備公司）；A10型超純水儀（美國Millipore公司）；DMI8型倒置顯微鏡（德國萊卡公司）；MDF-C8V1型-80℃超低溫冰箱（日本Sanyo公司）；FC500MCL型流式細胞儀（美國Beckman公司）。

試藥：DMEM培養(yǎng)基（批號為10569010）；胰蛋白酶（批號為 25200056）；EDTA（批號為 AM9260G）；胎牛血清（Fetal Bovine Serum，F(xiàn)BS，批號為 10099141）；二甲亞砜（Dimethyl sulfoxide，DMSO，批號為 D2650），均購自美國Gibco公司。麥冬皂苷D′（上海一飛生物科技有限公司，HPLC法測定，含量≥98%，批號為41753-55-3）；MTS細胞毒性檢測試劑盒（美國Promega公司，批號為G1780）；Annexin V-FITC ／PI凋亡測定試劑盒（美國Sigma-Aldrich 公司，批號為 APOAF-20TST）；JC-1型線粒體膜電位檢測試劑盒（碧云天生物技術(shù)公司，批號為 C2006）。

1.2 方法

細胞株培養(yǎng)：大鼠心肌細胞H9c2為貼壁細胞，在含有10%FBS，100 U／mL青霉素和100 g／L鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基中，置5%CO2、37℃ 細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞生長至約90%時，棄去原培養(yǎng)基，用PBS輕輕吹吸1～2次，后用預(yù)熱的0.25%胰蛋白酶消化、傳代，平均2 d傳代1次。

細胞存活率檢測：將H9c2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按3×104個／孔的細胞密度均勻接種于96孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的OPD′，對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h后棄去上清液，每孔加MTS 20 μL和不含血清培訓(xùn)基 100 μL，37 ℃孵育 0.5 ～1.0 h。用酶標(biāo)儀在 480 nm波長下檢測各孔吸光度（A），并計算細胞存活率。細胞存活率 ＝1-（OPD′組 A490-校零孔A490／對照組 A490-校零孔A490）×100%。

心肌細胞凋亡能力檢測：根據(jù)Annexin V-FITC／PI凋亡檢測試劑盒說明書進行操作。將H9c2細胞用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，按2×105個／孔的細胞密度均勻接種于6孔板。第2天待細胞貼壁生長后棄去培養(yǎng)基，用PBS洗去未貼壁細胞，加入新鮮培養(yǎng)基。OPD′組分別加入不同濃度（0.1，0.5，5.0，10.0 μmol／L）的 OPD′，對照組則加等量不含藥物的培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，棄去上清液，胰酶消化，離心，收集細胞，用250 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞并調(diào)整細胞濃度約為1×106個／mL。向細胞懸液中依次加入Annexin V-FITC和PI溶液，混勻，室溫避光孵育15 min，加入400 μL PBS，混勻后上流式細胞儀檢測分析。

心肌細胞周期檢測：按“心肌細胞凋亡能力檢測”項下自“將H9c2細胞”至“收集細胞”同法操作，70%冷乙醇（無水乙醇以PBS配制）固定過夜，PBS洗滌2次后棄上清液，PI染液冰浴30 min，將試管置室溫避光染色30 min，通過流式細胞儀分析細胞周期分布。

線粒體膜電位檢測：按“心肌細胞凋亡能力檢測”項下自“將H9c2細胞”至“加等量不含藥物的培養(yǎng)液”同法操作。繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用JC-1染色緩沖液（1×）洗滌2次。加入2 mL細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)液中可以含有血清和酚紅。采用流式細胞儀進行檢測，設(shè)置激發(fā)波長為525 nm，發(fā)射光波長為595 nm，測定熒光強度。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 OPD′對心肌細胞的細胞毒性

MTS法檢測OPD′對細胞的毒性見圖1。隨著OPD′處理濃度的增加，H9c2細胞數(shù)量呈明顯下降趨勢，其中5 μmol／L及以上濃度的OPD′對心肌細胞有明顯的毒性作用。

圖1 OPD′對H9c2細胞存活率的影響

2.2 OPD′對心肌細胞凋亡的影響

流式細胞儀檢測OPD′對心肌細胞H9c2凋亡的影響。與對照組相比，OPD′5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組凋亡率明顯上升（P＜0.05）。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可誘導(dǎo)H9c2細胞凋亡。詳見表1。

表1 OPD′對心肌細胞凋亡率的影響（±s，% ）

表1 OPD′對心肌細胞凋亡率的影響（±s，% ）

組別 凋亡率（%）t值P值對照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L 3.9 ±1.1 4.6 ±1.6 5.1 ±1.7 8.9 ±2.1 11.9 ±1.9 0.624 1.026 3.653 6.311 0.283 0.181 0.011 0.002

2.3 OPD′對心肌細胞周期的影響

流式細胞儀檢測H9c2細胞周期發(fā)現(xiàn)，5 μmol／L組和10 μmol／L 組 G0／G1期所占比例分別為（48.7 ±0.3）%和（61.4 ± 0.5）%，與對照組的（32.0 ± 0.4）%比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L組G0／G1期所占比例與對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），詳見表 2。提示 5 μmol／L 及以上濃度的OPD′可將心肌細胞阻滯于G0／G1期，進而造成心肌細胞周期失調(diào)。

表2 OPD′對心肌細胞周期的影響（%）

2.4 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響

流式細胞儀檢測OPD′對心肌細胞H9c2線粒體膜電位的影響，與對照組相比，OPD′0.1 μmol／L 組和0.5μmol／L 組細胞線粒體膜電位無明顯差異（P＞0.05），而 5 μmol／L 組和 10 μmol／L 組細胞線粒體膜電位明顯下降（P ＜0.01）。詳見表 3。

表3 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s）

表3 OPD′對心肌細胞線粒體膜電位的影響（±s）

注：與對照組比較，*P＜0.01。

組別對照組OPD′組 0.1 μmol／L 0.5 μmol／L 5.0 μmol／L 10.0 μmol／L MMP（FI）1.21 ± 0.37 0.95 ± 0.12 0.73 ± 0.21 0.41 ±0.14*0.09 ±0.03*t值P值1.157 1.954 3.503 5.226 0.156 0.061 0.012 0.003

3 討論

本研究結(jié)果顯示，OPD′濃度超過 5 μmol／L 時，H9c2細胞存活率明顯下降，凋亡率明顯下降，線粒體膜電位下降；且OPD′可阻滯H9c2細胞由G0／G1期進入S期，使心肌細胞周期失調(diào)。提示OPD′對大鼠H9c2細胞有明顯細胞毒性，可能是通過刺激凋亡通路活化而發(fā)揮作用的。線粒體膜電位的降低，是細胞凋亡級聯(lián)反應(yīng)過程中最早發(fā)生的事件，是細胞早期凋亡的重要指標(biāo)［6］。在凋亡信號的刺激下，線粒體的膜電位丟失，線粒體的通透性發(fā)生變化，線粒體產(chǎn)生三磷酸腺苷（ATP）的能力降低，無法維持其正常功能對細胞供能，細胞就會發(fā)生凋亡［7］。另一方面，熱休克蛋白Hsp90作為心臟保護蛋白ErbB2的分子伴侶，可通過與ErbB2結(jié)合發(fā)揮保護心臟的作用，而ATP的減少會降低Hsp90對ErbB2的親和力，其對心臟的保護作用也會下降［8］?？梢姡琌PD′可能通過影響高能磷酸池對心肌細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。

麥冬含多種甾體皂苷，具有抗疲勞、清除自由基、提高細胞免疫功能及降血糖的作用［9］。麥冬有鎮(zhèn)靜、催眠、抗心肌缺血、抗心律失常、抗腫瘤等作用，尤其對增進老年人健康具有多方面功效［10］。目前，對麥冬的藥理活性方面的研究主要集中于其粗提物，對其中單體化合物研究較少。OPD和OPD′作為麥冬的主要成分，結(jié)構(gòu)十分相似，差異僅為糖基側(cè)鏈取代不同，OPD含有巖藻糖取代基而OPD含葡萄糖取代基［11］。對于OPD的研究相對較多：OPD可通過降低阿霉素誘導(dǎo)的活性氧簇（ROS）累積，進而緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而對心肌產(chǎn)生保護作用［4］；OPD可通過抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其介導(dǎo)的細胞凋亡通路減輕大鼠心肌細胞的凋亡［12］；另外，OPD可通過降低自噬抑制血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)的心肌肥大［5］。OPD對心肌細胞的損傷、肥大均有保護作用，本研究中發(fā)現(xiàn)OPD′卻對心肌細胞產(chǎn)生細胞毒性作用。OPD與OPD′同為參麥注射液成分，參麥注射液可增加機體耐缺氧能力，減少心肌耗氧量，并有保護、修復(fù)心肌細胞的作用［13-15］，而其不良反應(yīng)可能與OPD′的細胞毒性相關(guān)。

綜上所述，一定濃度的OPD′對心肌細胞有促進凋亡作用，會干擾細胞周期，有一定細胞毒性。通過與OPD功能的對比發(fā)現(xiàn)，可通過優(yōu)化OPD′結(jié)構(gòu)的方式對藥物進行改良，但OPD′的具體作用機制和其在機體內(nèi)的轉(zhuǎn)化機制還需要作進一步研究。