袁雪艷, 黃 維, 陳澤明, 張曉華, 鄒小興, 鄒雙全

(福建農(nóng)林大學(xué)林學(xué)院/自然生物資源保育利用福建省高校工程研究中心，福建 福州 350002)

花青素屬于黃酮類物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤等生物活性[1]，是一種潛在的醫(yī)藥資源；另外，花青素是一種安全、無毒的天然色素，在食品添加劑領(lǐng)域極具開發(fā)前景.但花青素提純后，穩(wěn)定性較差，對pH、光照、溫度、金屬離子較敏感[2,3]，所以，花青素作為天然色素在工業(yè)中的應(yīng)用受到影響，加之富含花青素的原材料價格較高[4]，因此，尋找并開發(fā)富含花青素且價格便宜的原材料極為迫切.圓齒野鴉椿(EuscaphiskonishiiHayata)具有良好的觀賞價值和保健功能[5]，在福建、江西已有大規(guī)模的人工林及綠化應(yīng)用[6]，盛果期其掛果量較大，滿樹紅果尤為壯觀，是優(yōu)良的觀果樹種，但果實的食藥價值開發(fā)利用率較低.關(guān)于圓齒野鴉椿的研究大多集中在繁育體系[7-9]、品種篩選、化學(xué)成分研究[10,11]和藥理研究[12].研究表明，通常果實呈紅色與花青素積累密切相關(guān)，紅葡萄[13]、紅蘋果[14,15]、紅肉獼猴桃[16]和櫻桃[17]等，花青素都是其紅色果實的主要色素.調(diào)查發(fā)現(xiàn)圓齒野鴉椿果實成熟后果皮通紅，研究[18,19]表明，圓齒野鴉椿果皮富含花青素，是極具開發(fā)潛力的花青素原材料.傳統(tǒng)的花青素提取方法為熱浸提法，耗費時間長，得率低[20，21]；而微生物破壁法、超臨界萃取和酶工程技術(shù)等又會產(chǎn)生較高的成本[22]；超聲輔助提取法因其成本較低、節(jié)省時間且高效率等優(yōu)點，在花青素提取研究和工業(yè)生產(chǎn)中已得到廣泛應(yīng)用.本研究以圓齒野鴉椿果皮為原料，應(yīng)用超聲波進行輔助提取，基于單因素試驗結(jié)果，設(shè)計正交試驗，優(yōu)化圓齒野鴉椿果皮花青素的提取工藝條件；并對圓齒野鴉椿果皮花青素的抗氧化活性進行評價，為綜合評價圓齒野鴉椿果皮的深加工提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 供試材料

2017年10月25日，采集盛花期后160 d的圓齒野鴉椿果實，此時果實已沿背縫線開裂，內(nèi)外果皮已基本轉(zhuǎn)為紅色，達到成熟期.果實采集后將果皮和種子分開，并去除枝條樹葉等雜物，放入干冰運回實驗室，保存于-20 ℃冰箱備用.

1.2 儀器

KQ-500型超聲清洗器由昆山市超聲儀器有限公司提供；電子天平由奧豪斯儀器有限公司(上海)提供；Eppendorf移液器由Eppendorf公司(德國)提供；TU-1810紫外可見光光度計由北京普析通用儀器有限責(zé)任公司提供；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀由上海愛郎儀器有限公司提供；酶標(biāo)儀由賽默飛公司提供；吩嗪硫酸甲酯(PMS)、還原型輔酶Ⅰ、硝基四氮藍(NBT)均由北京索萊寶科技有限公司提供；DPPH由上海麥克林生化有限公司提供；其它試劑均為分析純.

1.3 方法

1.3.1 最大吸收波長的確定 待測液用紫外可見分光光度計在400～700 nm波長范圍掃描.繪制吸收光譜曲線，并找出峰值.以該波長測定提取液的光密度(D).

1.3.2 花青素的提取及測定 磨樣：用液氮將果皮研磨至粉末狀，備用.

浸提過濾：準(zhǔn)確稱取0.5 g(±0.001 0 g)粉末放入10 mL棕色離心管中，加入提取劑，以超聲波輔助浸提，過濾后置于50 mL容量瓶中，濾渣重復(fù)提取2次，最后用提取劑定容至刻度.

脫色：吸取2 mL提取液，置于10 mL容量瓶中，分別加pH=1的鹽酸—氯化鉀緩沖液和pH=4.5的醋酸—醋酸鈉緩沖液稀釋，搖勻，靜置平衡.

比色：將顯色液倒入比色杯(10 mm)中，多次少量潤洗，再用UV-2550紫外—可見分光光度計測定D.

計算：每個處理在相同條件下重復(fù)3次，取平均值，代入以下公式即可算出提取液的花青素含量.

花青素含量/(mg·g-1)=ΔDVFM×1 000/(εm)

式中，ΔD為(Dmax-D700 nm) pH 1.0-(Dmax-D700 nm) pH 4.5；V為稀釋體積(L)；F為稀釋倍數(shù)；M為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量(449.2 g·mol-1)；ε為矢車菊素-3-葡萄糖苷的摩爾消光系數(shù)26 900(L·mol-1·cm-1)；m為樣品質(zhì)量(g).

1.3.3 單因素試驗設(shè)計 提取條件的相關(guān)因素水平參考文獻[23].通過試驗確定最佳浸提劑(1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇(體積比15∶85)、0.1 mol·L-1鹽酸、1%鹽酸甲醇)和平衡時間(20、30、40、50、60、70、80、90、100 min)后，以超聲溫度(冰水、10、20、30、40、50、60、70 ℃)、超聲時間(10、20、30、40、50、60 min)、超聲功率(120、150、180、210、250、270、300 W)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12)為單因素，確定圓齒野鴉椿果皮花青素的最佳超聲輔助提取條件.對照：超聲溫度20℃，超聲時間10 min，超聲功率100 W，料液比1∶4.

1.3.4 正交試驗設(shè)計 在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，優(yōu)選最佳單因素條件后，選取4個關(guān)鍵因素(超聲溫度、超聲時間、超聲功率、料液比)，以花青素含量為考察指標(biāo)，設(shè)計四因素三水平的正交試驗.試驗設(shè)計見表1.

表1 正交試驗設(shè)計Table 1 Orthogonal experimental design

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Excle 2010對數(shù)據(jù)進行計算及圖表分析.利用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析.

A、B、C分別為1.5 mol·L-1鹽酸和95%乙醇(體積比為15∶85)混合液、0.1 mol·L-1鹽酸、1%鹽酸甲醇提取劑.圖1 提取劑對花青素提取量的影響Fig.1 Effect of extractant on anthocyanin extraction

2 結(jié)果與分析

2.1 提取劑和最大吸收波長的確定

從圖1可知，1%鹽酸甲醇和1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇(體積比15∶85)混合液提取花青素的效果顯著高于0.1 mol·L-1鹽酸，得率分別為3.637和3.567 mg·g-1.

利用可見紫外分光光度計在400～700 nm全波段掃描，在pH=1的緩沖液中，1%的鹽酸甲醇提取液和1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇混合液提取液均約在520 nm有吸收峰且無雜峰干擾(圖2)；在pH=4.5的緩沖液中，1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇(體積比為15∶85)提取液在400～600 nm范圍內(nèi)平穩(wěn)延伸，無干擾雜峰出現(xiàn)，能較好地起到模糊校正的作用(圖2a)，但1%鹽酸甲醇提取液出現(xiàn)較多的雜峰干擾，會嚴(yán)重影響花青素含量的估測(圖2b).因此，選擇1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇(體積比為15∶85)作為提取花青素的溶劑，在520 nm處測提取液的D值.

2.2 靜置平衡時間篩選

改變花青素的pH值，需要靜置一段時間，溶液達到平衡后再測定相應(yīng)的D值.由圖3可知，在待測樣品中加入pH=1和pH=4.5的緩沖液，常溫下靜置，隨著靜置平衡時間的延長，在520、700 nm波長下D的變化趨勢基本一致，即在20～30 min內(nèi)呈急劇上升的趨勢，30～90 min出現(xiàn)緩慢上升的趨勢，在90 min之后趨于平穩(wěn).結(jié)果表明，90 min后D趨于平穩(wěn)，因此本試驗的平衡時間為90 min.

2.3 超聲優(yōu)化提取結(jié)果

2.3.1 最佳超聲溫度 圖4為超聲溫度對圓齒野鴉椿花青素得率的影響.低溫時(冰水和10 ℃)，花青素的得率普遍較低，而出現(xiàn)冰水溫度大于10 ℃，可能是因為固體冰塊的超聲傳導(dǎo)率高于液體.隨著溫度的升高，花青素的提取量先快速增加到40 ℃，之后增加的幅度變緩，并在50 ℃時達到最大(3.849 mg·g-1)，溫度繼續(xù)升高至60 ℃，花青素的提取量下降為3.467 mg·g-1.

2.3.2 最佳超聲時間 在10～30 min內(nèi)，延長超聲時間能顯著提高花青素的提取量，最高值出現(xiàn)在30 min，繼續(xù)延長超聲時間，花青素的提取量無顯著變化，且超聲時間太長不僅會產(chǎn)熱，還會破壞部分花青素，不利于花青素的提取(圖5).

2.3.3 最佳超聲功率 將超聲功率從120 W增加至180 W，花青素的得率無顯著變化且均為低值，說明超聲功率過低對圓齒野鴉椿花青素的提取效果并不理想.超聲功率為180～240 W，花青素的得率快速增加；超聲功率大于240 W時花青素得率增幅減緩，在270 W出現(xiàn)最高值(3.613 mg·g-1)；繼續(xù)加大超聲功率至300 W，花青素得率急劇下降.說明超聲功率過高反而會破壞部分圓齒野鴉椿果皮的花青素，降低花青素得率(圖6).

a.1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇(體積比為15∶85)提取劑在400～700 nm內(nèi)全波段掃描;b.1%鹽酸甲醇提取劑在400～700 nm內(nèi)全波段掃描.圖2 不同提取劑的光譜掃描結(jié)果Fig.2 Spectral scanning results at different extractions

a.待測樣品加入緩沖液(pH=1和pH=4.5)后D520 nm隨時間的變化趨勢;b.待測樣品加入緩沖液(pH=1和pH=4.5)后D700 nm隨時間的變化趨勢.圖3 浸提劑D隨時間的變化趨勢Fig.3 Changes in the optical density of extractant along time

圖4 超聲溫度對花青素提取的影響Fig.4 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of anthocyanins

2.3.4 最佳料液比 由圖7可知，在料液比為1∶4和1∶6的條件下，提取圓齒野鴉椿果皮的花青素得率最高，過低的料液比(1∶2)不利于花青素的析出；繼續(xù)加大溶劑的比例，花青素得率呈逐漸下降的趨勢.通常溶劑量越大提取量也越大，但是過高的溶劑比例會造成溶劑的浪費，同時可能會把不易溶出的成分提取出來，造成類黃酮提取量下降.

圖6 超聲功率對花青素提取的影響Fig.6 Effect of ultrasonic power on the extraction of anthocyanins

2.4 正交試驗結(jié)果

由表2可知，影響花青素提取量因素的排列順序為：超聲溫度(A)>超聲時間(B)>料液比(D)>超聲功率(C)，依據(jù)K值和R值評估花青素提取的最佳工藝.結(jié)果表明，A1B3C3D2為圓齒野鴉椿果皮花青素提取的最佳組合，即超聲溫度40 ℃，超聲時間40 min，超聲功率300 W，料液比1∶6.在最佳提取條件下做6組平行試驗，驗證圓齒野鴉椿果皮花青素的提取效果，結(jié)果顯示，在最優(yōu)提取條件下，圓齒野鴉椿花青素提取量為(3.74±0.058) mg·g-1，略高于正交試驗的最高值(3.65 mg·g-1).因此，A1B3C3D2是提取圓齒野鴉椿果皮花青素的最佳提取方法.

表2 正交試驗結(jié)果1)Table 2 Output of the orthogonal experiment

1)n表示試驗重復(fù)次數(shù)，n=3.

2.5 圓齒野鴉椿花青素體外抗氧化活性

2.5.1 DPPH·的清除能力 加大溶液的質(zhì)量濃度，抗壞血酸的DPPH·清除率基本穩(wěn)定在88%左右.圓齒野鴉椿花青素的DPPH·清除率逐漸增高，并在1.6 mg·mL-1接近抗壞血酸，達到84.64%(圖8).說明溶液濃度大于1.6 mg·mL-1時，圓齒野鴉椿具有較高的DPPH·清除率，清除能力接近抗壞血酸.

2.5.2 ·OH的清除能力 清除·OH的能力是抗氧化物質(zhì)的一項重要指標(biāo).由圖9可知，加大圓齒野鴉椿和抗壞血酸的質(zhì)量濃度，清除·OH能力在0.1～0.8 mg·mL-1增幅緩慢；在質(zhì)量濃度大于0.8 mg·mL-1時清除·OH能力急劇增大；質(zhì)量濃度達3.2 mg·mL-1時，·OH清除率最高，抗壞血酸和圓齒野鴉椿花青素的清除率分別為99.86%和77.86%.

圖9 圓齒野鴉椿花青素和抗壞血酸對·OH的清除能力Fig.9 Scavenging ability of E.konishii anthocyanin and ascorbic acid on ·OH

3 小結(jié)

以圓齒野鴉椿果皮為原料，在確定最佳提取試劑(1.5 mol·L-1鹽酸+95%乙醇，體積比為15∶85)和最佳靜置時間(90 min)后，設(shè)計超聲輔助相關(guān)的4個單因素試驗(超聲溫度、時間、功率和料液比)，并在此基礎(chǔ)上，設(shè)計四因素三水平的組合試驗；建立超聲輔助提取果皮花青素的最佳工藝條件，即超聲溫度40 ℃，超聲時間40 min，超聲功率300 W，料液比1∶6；在該條件下青素提取量為(3.74±0.058) mg·g-1，效果較優(yōu)，時間短，且浸提液用量少.