洪 超， 趙雨笛， 譚 芳， 李盈甫， 馬千里， 劉楠楠， 劉舒媛， 史 荔， 李傳印**

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院&北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所， 云南 昆明 650118； 2.昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院， 云南 昆明 650032； 3.昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院， 云南 昆明 650118)

肺癌是現(xiàn)在最主要的導(dǎo)致死亡的惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球每年約有180萬新發(fā)病例及160萬死亡病例[1]，這其中近30%發(fā)生在中國(guó)[2]。雖然吸煙是肺癌發(fā)生的主要風(fēng)險(xiǎn)因素，但研究發(fā)現(xiàn)，過去十年肺癌患者中非吸煙人群的比例正逐漸升高[3]，提示除吸煙外其他因素在肺癌發(fā)生過程中也發(fā)揮重要作用，這其中比較重要的是遺傳因素[4-5]。CD133分子(又被稱為prominin-1)由PROM1基因表達(dá)，是跨膜糖蛋白家族成員之一，具有5次跨膜結(jié)構(gòu)，分子量約為120 kD[6]。CD133分子最早被發(fā)現(xiàn)表達(dá)于造血干細(xì)胞表面[7]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，CD133分子可能是多種腫瘤(肺癌、結(jié)直腸癌、肝癌等)干細(xì)胞的標(biāo)志分子[8-10]，并且與細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖、分化、遷移等過程密切相關(guān)[11-13]。在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)，CD133分子的表達(dá)水平與肺癌的發(fā)展呈正相關(guān)，且與肺癌預(yù)后不良相關(guān)[14]。位于CD133基因3-UTR區(qū)域的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms，SNPs)位點(diǎn)可能會(huì)通過影響與microRNA的相互作用而影響基因的表達(dá)調(diào)控，從而與疾病的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性[15-16]。因此，本研究選取了表達(dá)水平與肺癌發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性的CD133基因3-UTR區(qū)域中的兩個(gè)SNPs位點(diǎn)(rs2240688和rs3130)，研究其與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 樣本來源

本研究選取2014年5月～2017年10月在昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院被確診為非小細(xì)胞肺癌患者420例作為病例組，選取同期健康體檢的正常健康個(gè)體588例作為對(duì)照組。排除接收過放化療等腫瘤治療的患者，排除其他惡性腫瘤及慢性疾病的患者。所有參加者均為居住在云南地區(qū)，彼此無血緣關(guān)系的漢族個(gè)體。

1.2 方法

1.2.1樣本基因組DNA提取 采用QIAGEN全血基因組DNA提取試劑盒(QIAamp DNA Blood Mini Kit，貨號(hào)51106)提取研究對(duì)象基因組DNA，測(cè)定DNA的濃度和純度后置于-20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2SNPs位點(diǎn)的基因分型 SNPs位點(diǎn)的基因分型采用TaqMan探針基因分型方法，CD133基因中的兩個(gè)SNPs位點(diǎn)rs2240688和rs3130基因分型試劑盒購(gòu)于美國(guó)ABI(Applied Biosystems)公司，編號(hào)分別為C_____89927_1_和C_____89925_20。TaqMan探針熒光定量PCR使用美國(guó)ABI公司的Quant Studio 6實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，PCR反應(yīng)體系為20 μL，反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，92 ℃變性15 s、60 ℃退火1 min(40個(gè)循環(huán))，40 ℃最后延伸5 min，PCR過程設(shè)陰性對(duì)照(以水代替DNA模板)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用χ2檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組樣本性別差異，獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析病例組和對(duì)照組年齡差異，Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析本研究納入樣本的群體代表性；使用在線軟件SHEsis[17-18]分析CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688和rs3130位點(diǎn)的連鎖關(guān)系，并根據(jù)連鎖不平衡結(jié)果構(gòu)建兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的單倍型，兩個(gè)SNPs位點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性分析采用χ2檢驗(yàn)；P<0.05說明不同組間的數(shù)據(jù)比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究樣本基本信息及群體代表性檢驗(yàn)

本研究共納入非小細(xì)胞肺癌患者420例，正常健康個(gè)體588例；病例組平均(55.75±10.57)歲，男289例、女131例；對(duì)照組平均(55.41±8.13)歲，男399例、女189例。病例組和對(duì)照組間年齡、性別比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，CD133基因3-UTR區(qū)域的兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的基因型在病例組(P=0.28，P=0.95)、對(duì)照組(P=0.65，P=0.49)均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)表明本研究所選取的樣本具有群體代表性。

2.2 rs2240688及rs3130位點(diǎn)與非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性分析

CD133基因3-UTR區(qū)域的rs2240688及rs3130等位基因和基因型在非小細(xì)胞肺癌病例組和對(duì)照組中的分布特征見表1。結(jié)果顯示，rs2240688位點(diǎn)等位基因和基因型分布頻率在病例組和對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.013、0.033)；而rs3130等位基因和基因型分布頻率在病例組和對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。進(jìn)一步分析的結(jié)果顯示，rs2240688位點(diǎn)等位基因G是云南漢族非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)性因素(OR=1.301，95%CI為1.056～1.601)。

表1 兩組被檢者CD133基因rs2240688和rs3130位點(diǎn)等位基因、基因型頻率分布Tab.1 The frequency distributions of alleles and genotypes of rs22406882 and rs3130 in the 3-UTR of CD133 gene between case and control groups

2.3 rs2240688和rs3130位點(diǎn)的連鎖不平衡分析及單倍型構(gòu)建

結(jié)果顯示，rs2240688及rs3130 SNPs位點(diǎn)間存在強(qiáng)連鎖(D′>0.8)。構(gòu)建兩個(gè)SNPs位點(diǎn)的單倍型，并分析分布頻率>3%的單倍型在病例組和對(duì)照組中分布頻率差異，結(jié)果顯示兩組單倍型rs2240688G-rs3130C及rs2240688T-rs3130C分布頻率比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.046、0.043)。進(jìn)一步分析結(jié)果顯示，單倍型rs2240688G-rs3130C與肺癌風(fēng)險(xiǎn)升高有關(guān)(OR=1.238，95%CI為1.003～1.528)，而單倍型rs2240688T-rs3130C可能是肺癌發(fā)生的保護(hù)性因素(OR=0.828，95%CI為0.690～0.994)。見表2。

表2 兩組被檢者CD133基因rs22406882和rs3130位點(diǎn)單倍型分布頻率Tab.2 The haplotype distributions of rs22406882 and rs3130 in the 3-UTR of CD133 gene

3 討論

肺癌是全球最常見的惡性腫瘤，發(fā)病率及死亡率均較高，非小細(xì)胞肺癌是最主要的肺癌類型，約占肺癌病例的90%。雖然肺癌治療手段越來越多，具有較好的治療效果，但由于患者檢出時(shí)多為晚期，治療難度較大，且預(yù)后不良。所以尋找與肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的分子標(biāo)記，早期診斷對(duì)于降低肺癌的死亡率具有重要的意義。

CD133分子是眾多腫瘤干細(xì)胞的標(biāo)記分子[19-21]，并且在腫瘤患者預(yù)后判斷中發(fā)揮重要作用[22-23]，在肺癌的研究中發(fā)現(xiàn)CD133分子的表達(dá)水平與肺癌的發(fā)展及預(yù)后具有相關(guān)性[14]。這說明腫瘤細(xì)胞CD133分子的表達(dá)水平不僅與肺癌的發(fā)生發(fā)展具有相關(guān)性，而且還可作為肺癌預(yù)后判斷的分子標(biāo)記。因此，推測(cè)影響CD133基因表達(dá)的因素可能也會(huì)影響肺癌的發(fā)生發(fā)展。而且已有研究表明位于CD133基因3-UTR區(qū)域的SNPs位點(diǎn)(例如rs2240688和rs3130)與多種人類腫瘤具有相關(guān)性。因此本研究選取了位于CD133基因中的SNPs位點(diǎn)rs2240688和rs3130，研究其與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)的相關(guān)性。結(jié)果顯示，rs2240688位點(diǎn)等位基因G在病例組中的分布頻率顯著高于對(duì)照組，可能是云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素(OR=1.301;95%CI為1.056～1.601)，而rs3130可能與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無關(guān)。該結(jié)果與Liu等和Mei等[24-25]在肺癌中的研究結(jié)果一致。因此，位于CD133基因3-UTR區(qū)域的SNPs位點(diǎn)rs2240688可能是通過影響microRNA的靶向結(jié)合來影響CD133基因的表達(dá)，從而與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)具有相關(guān)性。

另外，本研究構(gòu)建了CD133基因3-UTR區(qū)域2個(gè)SNP位點(diǎn)的單倍型，并分析了構(gòu)建的單倍型與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的相關(guān)性。結(jié)果顯示，單倍型rs2240688G-rs3130C可能與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)升高相關(guān)，相反，單倍型rs2240688T-rs3130C可能會(huì)使云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)降低。這也與等位基因分析結(jié)果rs2240688等位基因G是云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的風(fēng)險(xiǎn)性因素相符。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rs2240688與云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，其等位基因G可能是云南漢族人群非小細(xì)胞肺癌發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。同時(shí)，本研究還發(fā)現(xiàn)，本次研究的結(jié)果與其他在中國(guó)人群的研究結(jié)果相符，為CD133基因3-UTR區(qū)域SNPs位點(diǎn)作為非小細(xì)胞肺癌診斷標(biāo)記提供了云南漢族人群的研究結(jié)果。