田平平， 石明雋**

(1.貴州醫(yī)科大學 病理生理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州醫(yī)科大學 貴州省常見慢性疾病發(fā)病機制及藥物研究重點實驗室， 貴州 貴陽 550025)

腎臟纖維化(renal fibrosis)是各種原因引起的慢性腎臟疾病(chronic kidney diseases，CKD)進行性發(fā)展的共同病理結(jié)果，也是導致終末期腎衰竭(end-stage renal disease，ESRD)的關鍵原因。這一過程的特征性病理變化為腎小球硬化和腎小管間質(zhì)纖維化(tubulointerstitial fibrosis,TIF)。腎臟纖維化的發(fā)病機制復雜，早期診斷較為困難，目前尚無有效的治療方法。大量文獻報道Wnt/β-catenin 信號通路在腎臟纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用[1-3]；近年，有研究證明微小RNA(microRNA，miRNA) 參與了腎臟纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展[4-6]。本文就miRNA調(diào)控經(jīng)典Wnt/β-catenin 信號通路對腎臟纖維化疾病的影響進行總結(jié)，為以后腎臟纖維化及其防治研究提供參考。

1 miRNA

1993年，Lee等[7]從秀麗隱形桿線蟲(caenorhabditiselegans)體內(nèi)發(fā)現(xiàn)的一種對其生長發(fā)育至關重要的新基因lin4,其與lin-14 mRNA的3′非編碼區(qū)(3′untranslated regions,3′UTR)有重復的互補序列，也是首次發(fā)現(xiàn)的miRNA。

miRNA是一類由內(nèi)源基因編碼的長度為19～25個核苷酸的非編碼單鏈RNA 分子，miRNA來源于細胞內(nèi)基因組編碼的RNA前體(pri-miRNA)，pri-miRNA于細胞質(zhì)中在Dicer酶的作用下形成成熟的miRNA，主要通過兩種方式調(diào)控基因的表達：(1)成熟的miRNA與Dicer、Argonaute(AGO)等相關蛋白結(jié)合后形成一種RNA誘導基因沉默復合體(RNA induced silencing complex,RISC)，RIS能與mRNA 3′UTR區(qū)的靶序列特異性結(jié)合，若兩者序列完全互補，則切割靶mRNA，若兩者序列不完全互補，則抑制靶蛋白的翻譯；(2)miRNA在哺乳動物中高度保守，調(diào)節(jié)相當數(shù)量的基因并參與一些關鍵的生命過程，miRNA的失調(diào)可能導致細胞功能受損，并且與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關。越來越多的證據(jù)表明，在真核生物中miRNA的調(diào)控作用涉及個體發(fā)育、細胞分化、增殖、代謝、凋亡和腫瘤等[8-10]。近年來研究也證實miRNA在腎臟疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[5-6]。

2 Wnt信號通路

目前，在哺乳動物體內(nèi)證實有20種Wnt基因存在，其編碼的Wnt蛋白是動物進化過程中十分保守的分泌型糖蛋白，調(diào)控著Wnt信號通路[11]。Wnt信號通路是生物體發(fā)育發(fā)展的一個重要信號通路，其內(nèi)在多級調(diào)節(jié)已得到大量研究及廣泛認可。在正常生理狀態(tài)下，Wnt信號通路按程序有序的激活與靜止，參與胚胎發(fā)育和組織發(fā)展過程中細胞增殖、分化以及凋亡的過程[8-9]。Wnt信號通路分為經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路(Canonical Wnt/β-catenin pathway)和非經(jīng)典的平面細胞極性通路(planar cell polarity pathway)、Wnt/Ca2+通路等。

2.1 經(jīng)典Wnt信號通路

經(jīng)典Wnt信號通路的成員主要包括：細胞外因子(Wnt)、跨膜受體(frizzled，F(xiàn)rz)、Wnt共受體低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LDL-receptor-related protein,LRP5/6)、散亂蛋白(dishevelled,Dsh或Dvl)、軸蛋白(Axin)、腫瘤基因抑制物大腸瘤樣息肉蛋白(APC)、酪蛋白激酶1(CK1)和糖原合酶激酶3β(GSK3β)、β-連環(huán)蛋白(β-catenin)及核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子淋巴樣增強因子/T細胞因子(LEF/TCF)等一系列蛋白；其中Frz蛋白是一種7次跨膜蛋白，具有高度保守富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(cystein rich domain,CRD)，F(xiàn)rz在胞外端的CRD區(qū)能夠與Wnt配體結(jié)合。當缺乏Wnt信號因子時，胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin 與CK1、GSK3β、APC及Axin形成降解復合物，而CK1和GSK3β可以使胞質(zhì)內(nèi)的β-catenin 蛋白磷酸化(常見磷酸化位點33、37位絲氨酸以及41位色氨酸)，磷酸化的β-catenin 可被E3泛素化連接酶復合體上的亞基Fbox/WD重復蛋白( β-Trcp)識別而泛素化后被蛋白酶體降解，故β-catenin 在胞漿中保持較低水平無法進入細胞核，從而限制Wnt信號通路下游靶基因的表達；當Wnt/β-catenin信號通路被激活時，Wnt蛋白與Frz和LRP5/6受體結(jié)合，此時Frz的胞內(nèi)端會與作用于β-catenin和GSK3β上游的Dvl結(jié)合并使其磷酸化[12]；隨后DVL多聚化并誘導LRP-Wnt信號小體的形成，Dvl反過來募集Axin以及Gsk3β使β-catenin降解復合物解體，此時β-catenin不能降解進而在胞漿中積累后入核，與 LEF/TCF結(jié)合激活Wnt靶基因轉(zhuǎn)錄，包括纖維化相關基因如纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metallo proteinases-7，MMP-7)、Ⅰ型纖溶酶原激活物抑制因子(plasminogen activator inhibitor-1，PAI-1)、Twist 及Snail等，活化Wnt信號通路，調(diào)控細胞的生長，分化，影響組織細胞的功能。

2.2 非經(jīng)典Wnt信號通路

非經(jīng)典的Wnt信號通路是一種不依賴β-catenin的傳導方式，包括平面細胞極性通路(planar cell polarity pathway)，即Wnt /PCP 通路、Wnt/Ca2+通路。在哺乳動物中Wnt /PCP 通路是一種高度保守的信號通路，主要參與調(diào)控細胞的骨架重排與基因的表達；Wnt/Ca2+通路主要通過激活磷脂酶C(PKC)和蛋白激酶C(PKC)調(diào)控細胞內(nèi)Ca2+進而激活下游靶基因的表達，參與神經(jīng)退行性變、炎癥和癌癥等過程[9]。

2.3 Wnt信號通路拮抗因子

根據(jù)結(jié)合部位不同，Wnt信號通路拮抗因子主要分為兩種，一種可以與Wnt受體直接結(jié)合，如分泌型卷曲相關蛋白(secreted frizzled-related protein family SFRPs)及Wnt抑制分子(Wnt inhibitory factors，WIFs)；另一種與Wnt共受體LRP5/6結(jié)合，包括Dickkopfs(DKKs)家族和Wise/SOST家族。

2.3.1SFRPs是一種調(diào)控Wnt信號通路的分泌性糖蛋白，也是第一個被發(fā)現(xiàn)的Wnt拮抗劑。SFRPs由大約300個氨基酸組成，結(jié)構(gòu)上缺乏跨膜區(qū)，由信號序列、親水的發(fā)夾結(jié)合域組成的C-端以及含有CRD結(jié)構(gòu)的N-端組成。其有5個家族成員，包括SFRP1～5，因與Wnt信號通路中的特異性受體Frz在結(jié)構(gòu)上具有同源的CRD區(qū)域，因此可與Frz競爭性結(jié)合Wnt配體而抑制經(jīng)典或非經(jīng)典Wnt信號通路[13]。研究證實，SFRPs參與調(diào)控細胞增殖、分化，在多種腫瘤組織中呈低表達狀態(tài)[14-15]。所以，SFRPs被認為是一類腫瘤抑制因子。

2.3.2WIFs WIF1第一次被發(fā)現(xiàn)是在人類視網(wǎng)膜細胞中，WIF1在多種組織細胞中廣泛表達，尤其是腦、視網(wǎng)膜、肺臟及軟骨等組織中。WIF1是一種由379個氨基酸組成的蛋白質(zhì)，具有高度保守的WIF1結(jié)構(gòu)域、5個表皮生長因子(epidermal augmentum factor,EGF)重復序列及一個親水性尾[13]。Hsieh在非洲爪蟾蜍胚胎中證實，功能與SFRPs相似，WIF1能夠通過阻斷Wnt與其受體結(jié)合，進而影響經(jīng)典或非經(jīng)典Wnt信號通路[16]。研究證實，在軟骨發(fā)育過程中，WIF1可以與信號通路中Wnt蛋白結(jié)合(如Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt7a、Wnt9a及Wnt11)調(diào)控Wnt活性[17]。但WIF1調(diào)控Wnt信號通路的具體機制仍不十分清楚，但與SFRPs一樣，WIF1也參與了腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[18-20]。

2.3.3DKK在脊椎動物中，DKK家族由4個成員組成,即DKK1～4。它們由255～350個氨基酸組成且含有兩個保守的CRD。在Wnt蛋白活化的多種信號通路中，DKK家族特異性的抑制Wnt/β-catenin信號通路。研究發(fā)現(xiàn)，DKK1、DKK 2及DKK 4可以與LRP6結(jié)合，調(diào)控Wnt信號通路，而DKK3不與LRP6結(jié)合，卻可以調(diào)控TGF-β信號通路[21-22]。

2.3.4Wise Wise也被稱為SOSTDC1、Ectodin或USAG-1。在非洲爪蟾中，Wise是Wnt信號的一個環(huán)境依賴性調(diào)節(jié)因子，它可以抑制或激活不同實驗中的Wnt信號通路[13]。研究發(fā)現(xiàn)[23-24]，Wise和SOST可以抑制BMP信號通路,但具體病理生理機制仍不清楚。

3 腎臟纖維化

腎臟纖維化是多種CKD發(fā)展的最終結(jié)局，是腎小球、腎小管等在持續(xù)損傷情況下表現(xiàn)出的形態(tài)學結(jié)果。由于腎臟結(jié)構(gòu)進行性破壞，導致腎小球硬化、腎小管間質(zhì)纖維化等，最終引起腎臟功能喪失。

3.1 腎小球硬化相關細胞

腎小球固有細胞包括足細胞、系膜細胞、內(nèi)皮細胞，它們均能產(chǎn)生不同程度的細胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)，如Ⅳ型膠原(col-Ⅳ)、纖連蛋白(Fibronectin，F(xiàn)N)、層黏蛋白等。正常情況下，它們行成基底膜構(gòu)架，對維持正常腎小球結(jié)構(gòu)、固定臨近細胞和形成濾過屏障起主要作用。病理情況下，當ECM合成增加并不斷積聚于系膜區(qū)，擠壓毛細血管腔，造成腎小球細胞不斷凋亡，使腎小球濾過功能逐漸減退。

3.2 腎小管間質(zhì)纖維化相關細胞

腎小管間質(zhì)纖維化涉及細胞眾多，包括腎小管上皮細胞、肌成纖維細胞、成纖維細胞、纖維細胞、肥大細胞及各種炎細胞等。腎小管上皮細胞在急性腎損傷的情況下可改變細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導和基因表達，如波形蛋白增多，Ⅰ型、Ⅲ型膠原增多，E-鈣黏蛋白(E-cadherin，E-ca)表達減少，引起腎臟纖維化，為間質(zhì)纖維化提供關鍵的信號。肌成纖維細胞表達平滑肌肌動蛋白(smooth muscle actin，SMA)，此細胞常與基底膜相連，產(chǎn)生大量的ECM。成纖維細胞是ECM的主要來源，在接觸損傷的腎小管基底膜后，通過旁分泌信號傳導可導致成纖維細胞獲得肌成纖維細胞形態(tài)，引起Ⅲ型膠原的產(chǎn)生。

4 Wnt/β-catenin信號通路與腎臟纖維化

Wnt信號通路是一類廣泛存在于真核生物中高度保守的信號通路，在生物體的發(fā)育發(fā)展起著重要作用，參與了細胞的增殖、分化以及凋亡的過程。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路與腎臟纖維化疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[4-6]。

4.1 Wnt/β-catenin信號通路與腎小球硬化

足細胞是一種終末分化細胞，一旦損傷便不可以修復。足細胞內(nèi)含有大量的血管微絲，構(gòu)成肌動蛋白的細胞骨架，維持足細胞靜態(tài)與動態(tài)結(jié)構(gòu)；一旦腎小球受到損傷，足細胞會產(chǎn)生各種表型改變以及細胞脫失，進而引起毛細血管壁塌陷、系膜細胞的增生以及ECM的沉積，最終引起腎小球硬化。研究表明，Wnt/β-catenin信號通路活化可以引起足細胞功能紊亂，促進蛋白尿的形成[25-26 ]。在體內(nèi)過表達Wnt1可以激活腎小球中β-catenin的表達、加速蛋白尿的形成；而用Wnt信號通路拮抗基因DKK1阻斷Wnt信號可以改善足細胞損傷。另外,在糖尿病腎病和局灶節(jié)段性腎小球硬化疾病中，觀察到足細胞中Wnt1及β-catenin表達明顯增多。Wang[5]發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的系膜細胞中，Wnt信號通路關鍵分子β-catenin表達明顯增多，而用黃芪甲苷Ⅳ處理后，β-catenin表達顯著減少。Lin[3]發(fā)現(xiàn)在CKD大鼠腎組織中，凋亡相關蛋白Caspase-3、Bax蛋白表達明顯增多，Bcl-2表達減少，Wnt信號通路關鍵分子β-catenin表達增多；而在體外系膜細胞發(fā)現(xiàn)β-catenin si-RNA可以明顯抑制TNF-α誘導的細胞凋亡且抑制纖維化相關指標如FN、TGF-β、 collagen I、collagen III 及 collagen IV的表達。細胞在特定的環(huán)境下發(fā)生的形態(tài)、結(jié)構(gòu)以及功能的改變成為表型轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)分化、去分化。研究證實，在CKD中，即便系膜細胞損傷不是始動原因，仍可成為腎小球硬化的中心環(huán)節(jié)，在損傷因素刺激下，系膜細胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，引起系膜細胞增殖產(chǎn)生大量ECM，細胞因子合成增加，通過各種途徑促進細胞增殖，ECM積聚，引起腎小球硬化，最終導致腎衰竭。

4.2 Wnt/β-catenin信號通路與腎小管間質(zhì)纖維化

孔靜等[27]研究發(fā)現(xiàn)Wnt4/β-catenin信號通路活化可以促進糖尿病腎病大鼠腎小管纖維化的發(fā)展。He[28]也發(fā)現(xiàn)Wnt拮抗基因DKK-1可以減少UUO小鼠腎臟中β-catenin的積累，抑制Wnt/β-catenin信號通路靶基因的表達，從而抑制col-Ⅰ、FN的表達，減少腎間質(zhì)纖維化的發(fā)生。研究發(fā)現(xiàn)給CKD小鼠腹腔注射硫酸吲哚酚后，β-catenin表達水平明顯增多，α-SMA以及膠原沉積更加明顯，而Wnt/β-catenin信號通路拮抗因子SFRP5因發(fā)生DNA甲基化而表達顯著下降[1]；利用DNA甲基轉(zhuǎn)移酶藥物5-Aza-cytidine或SFRP5重組蛋白處理硫酸吲哚酚腹腔注射過的CKD小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)β-catenin表達水平明顯降低，α-SMA以及膠原沉積顯著減少，提示SFRP5可以抑制Wnt/β-catenin信號通路改善腎小管纖維化的發(fā)生。

5 miRNA參與Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控與腎臟纖維化疾病的關系

近年來，miRNA引起了廣泛關注，并被證實miRNA通過與mRNA 3′UTR結(jié)合，導致mRNA降解，進而參與多種腎臟纖維化疾病的發(fā)生。Wu[29]發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞和STZ誘導的Ⅰ型糖尿病大鼠腎組織中，miR-27a通過負性調(diào)控PPAR-γ的3′UTR區(qū)域促進ECM沉積，而miR-27a的反義寡核苷酸可以顯著降低STZ誘導的糖尿病大鼠腎組織中miR-27a的表達，減少ECM和蛋白尿的沉積；同時在高糖培養(yǎng)的腎小球系膜細胞中轉(zhuǎn)染miR-27a的抑制劑，發(fā)現(xiàn)系膜細胞的增值能力明顯降低，提示miR-27a可以促進系膜細胞的增殖以及ECM的沉積。最近也有文獻報道在高糖培養(yǎng)的足細胞中形成miR-27a/PPARγ/β-catenin通路，引起足細胞損傷，使得miRNA成為潛在的治療DN的靶點[32]。上皮細胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition ，EMT)是上皮細胞經(jīng)過多種生物化學改變獲得間充質(zhì)細胞表型的過程，也是腎臟纖維化發(fā)生的關鍵因素，目前發(fā)現(xiàn)EMT過程受miRNA調(diào)控，如miRNA-29b[30]，miRNA-27a[31]等。TGF-β是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強的引起纖維化的因子， He[6]發(fā)現(xiàn)在TGF-β處理的HK-2細胞中，不僅有細胞表型發(fā)生EMT轉(zhuǎn)變的現(xiàn)象，也發(fā)現(xiàn)miRNA-328的表達呈下降趨勢，為了進一步研究miRNA-328對腎臟纖維化的發(fā)病機制，He在TGF-β誘導的HK-2細胞中再次轉(zhuǎn)染miRNA-328 mimics，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β,α-SMA ,Fibr,col-Ⅱ RNA和蛋白水平表達均有所下降，同時E-ca表達水平顯著提高，即miR-328 mimics明顯抑制了 TGF-β誘導的EMT的發(fā)生。Wang[5]發(fā)現(xiàn)在高糖培養(yǎng)的足細胞和系膜細胞中，miR-21表達增加，且有細胞表型的變化，且miR-21的過表達增加了active-β-catenin的表達水平，作者進一步應用Wnt抑制劑XAV-939刺激足細胞和系膜細胞，這一現(xiàn)象被逆轉(zhuǎn)。Liu[33]研究發(fā)現(xiàn)，在HK2細胞中miR-21可以靶向調(diào)控DDAH1活化Wnt/β-catenin信號通路促進間質(zhì)纖維化與細胞凋亡。Li[34]研究發(fā)現(xiàn)在缺血再灌注損傷的大鼠模型以及缺氧處理的大鼠腎小管上皮細胞中，miR-182表達明顯增多，而且證實miR-182可以抑制TCF7L2的表達活化Wnt/β-catenin信號通路加速缺氧誘導的細胞凋亡。這些發(fā)現(xiàn)證實miRNA與Wnt信號通路之間的相互作用，并提供了一個miRNA-Wnt信號通路-細胞生理過程的調(diào)控機制，然而關于miRNA與Wnt信號通路在腎臟纖維化發(fā)病機制的研究仍需進一步的闡明。

6 問題與展望

目前，腎臟纖維化疾病仍是臨床與基礎研究的一大難題，Wnt/β-catenin通路功能異常在人類腎臟纖維化疾病中有顯著的表現(xiàn)。目前的研究對于Wnt信號通路在腎臟纖維化疾病發(fā)生發(fā)展中的調(diào)控機制尚未徹底闡明，但也正是由于Wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中的調(diào)控機制的復雜性使其為各種纖維化疾病提供許多潛在的治療靶點。隨著近年來對Wnt/β-catenin信號通路在腎臟纖維化疾病中的作用及該通路所受到的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控機制的認識逐漸加深，使部分miRNA對Wnt/β-catenin信號通路的調(diào)控方式、調(diào)控機制以及對機體的影響得到進一步的了解，也為腎臟纖維化疾病的靶向治療提供新的思路，進一步深入研究兩者的調(diào)控機制及生物學功能對未來腎臟纖維化疾病的臨床治療有重要意義。