郭永清，張小宇，陳玉潔，王 勇，楊 鳳

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，內(nèi)蒙古包頭 014109；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

銅是酶- 輔酶催化反應(yīng)、氧轉(zhuǎn)運(yùn)和血紅蛋白合成等生化過(guò)程所需的微量礦物質(zhì)元素（Kim 等，2008），同時(shí)它用于家禽具有促生長(zhǎng)和抗病作用（Richards 等，2010）。家禽養(yǎng)殖中，銅常作為替代抗生素的首選微量元素，對(duì)家禽生長(zhǎng)性能的影響可以達(dá)到與抗生素一致的效果。理論上，日糧添加越多的銅其促生長(zhǎng)效果越好，但實(shí)際日糧銅水平升高會(huì)導(dǎo)致家禽和豬的消化率降低，過(guò)多的銅經(jīng)糞便排出，對(duì)環(huán)境造成污染（Zhao 等，2010）。有學(xué)者認(rèn)為，無(wú)機(jī)銅較有機(jī)銅或納米銅的生物學(xué)效率低，但關(guān)于有機(jī)銅對(duì)家禽生長(zhǎng)或免疫方面的研究結(jié)果存在差異（Creech 等，2004），還有待進(jìn)一步探討。雞整個(gè)生命周期中有近40% 的時(shí)間是在胚胎中度過(guò)，因此，胚胎發(fā)生期是雞生長(zhǎng)過(guò)程中最關(guān)鍵的時(shí)期（Azaranova 等，2012）。Yair 和Uni（2011）認(rèn)為胚胎在孵化的最后幾天，蛋黃中銅含量低會(huì)導(dǎo)致胚胎缺乏礦物質(zhì)，在此期間，胚胎可利用的銅較少；因此，體外給胚胎提高銅理論上可以提高雞蛋的孵化性能和仔雞生長(zhǎng)性能。有研究表明，給雞胚體外注射納米銅較硫酸銅更能滲透進(jìn)入胚胎組織，從而可以提高生長(zhǎng)性能，同時(shí)體外注射納米銅也對(duì)胚胎無(wú)毒害作用，對(duì)出生仔雞的死亡率也無(wú)顯著影響（Joshua 等，2016）。納米銅可以在細(xì)胞和核膜之間移動(dòng)，穿透細(xì)胞和細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)，移動(dòng)到體內(nèi)指定的目標(biāo)點(diǎn)。有研究表明，50 mg/kg 納米銅可以在分子和系統(tǒng)水平上增強(qiáng)胚胎血管敏感性，因此，本試驗(yàn)通過(guò)體外注射納米銅和硫酸銅，研究其對(duì)雞胚代謝的影響，其中耗氧量和能量消耗量是重點(diǎn)考察指標(biāo)，它們是評(píng)估胚胎代謝率的重要指標(biāo)（Tona 等，2004）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)選擇240 枚SPF 受精蛋，隨機(jī)分為6 組，每組4 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10 枚雞蛋。雞蛋入孵當(dāng)天對(duì)照組不做任何處理，陰性對(duì)照組注射0.25 mL 去離子水，硫酸銅組分別注射0.25、50 和100 mg/kg 硫酸銅，納米銅組分別注射0.25、50 和100 mg/kg 納 米 銅（5 ～10 nm，99% 純 度，購(gòu)自四川吉隆達(dá)集團(tuán)），即每個(gè)雞蛋注射12.5 或25 μg 硫酸銅或納米銅。受精蛋注射硫酸銅或納米銅后，將蛋放入孵化箱孵化21 d，其中1 ～18 d 孵化溫度為37.8℃，相對(duì)濕度為60%，每天翻蛋1 次；19 ～21 d 孵化溫度為37℃，相對(duì)濕度為70%。

1.2 胚胎代謝 分別在孵化的第12、14、16 和18天進(jìn)行代謝測(cè)定，具體測(cè)定方法參考Chwalibog等（2007）的方法，其中氧耗量通過(guò)氧交換機(jī)進(jìn)行測(cè)定，由于雞蛋重量存在差異，因此，統(tǒng)一化成50 g雞蛋的耗氧量。計(jì)算公式如下：

1.3 血液指標(biāo)及組織器官重量 在孵化結(jié)束當(dāng)天，每個(gè)重復(fù)隨機(jī)選擇5 只雞稱重后采血，頸部處死。血液離心后分離血清，用試劑盒法測(cè)定血清白蛋白、堿性磷酸酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、膽固醇、肌酸苷、甘油三酯、磷酸鹽、尿素氮和葡萄糖含量（試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所）。仔雞出殼后稱量卵黃囊重，分離屠宰雞的心臟、肝臟、小腸和胸肌，稱其重量

1.4 基因表達(dá) 將肝臟組織和胸肌組織在液氮條件下磨碎，用Trizol 法提取總RNA，參考Sawosz 等（2012）的研究方法，其中肝臟組織分析核因子和腫瘤壞死因子α 基因的相對(duì)表達(dá)量，胸肌組織分析血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 基因的相對(duì)表達(dá)量。熒光定量PCR 結(jié)果均以β-actin 基因作為內(nèi)參。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 一般線性模型進(jìn)行分析，用Ducan’s 法進(jìn)行多重比較。其中耗氧量和能量消耗量的差異采用LSD 法，具體模型為Yij=u+ai+bj+（ab）ij+eij，其中u 表示試驗(yàn)數(shù)據(jù)平均值，ai表示各處理組效應(yīng)，bj表示孵化天數(shù)，（ab）ij表示組別和日齡的交互效應(yīng)，eij表示殘差。以P ＜0.05 作為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚代謝速度的影響 由表1 可知，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，雞胚注射硫酸銅和納米銅提高了雞胚耗氧量。雞胚注射50 mg/kg 納米銅較其他組顯著提高了16 和18 d 雞胚耗氧量（P ＜0.05），而100 mg/kg 硫酸銅較50 mg/kg 硫酸銅組顯著提高了12 和14 d 雞胚耗氧量（P ＜0.05），同時(shí)100 mg/kg 納米銅較50 mg/kg 納米銅顯著提高了各日齡雞胚的耗氧量（P ＜0.05）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對(duì)雞胚孵化全期耗氧量無(wú)顯著影響（P ＞0.05）。

表1 硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚耗氧量的影響 mL/h

雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚能量消耗量的影響見(jiàn)表2，雞胚注射硫酸銅或納米銅較對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著提高了各日齡雞胚能量消耗（P ＜0.05）。除了18 d 雞胚外，100 mg/kg 硫酸銅較50 mg/kg 硫酸銅均顯著提高了雞胚能量消耗（P ＜0.05）。50 mg/kg 納米銅較100 mg/kg 納米銅顯著提高了12 d 雞胚能量消耗（P ＜0.05），但在后期各階段均顯著低于100 mg/kg 納米銅（P ＜0.05）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對(duì)雞胚孵化全期能量消耗無(wú)顯著影響（P ＞0.05）。

表2 硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚能量消耗的影響

2.2 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對(duì)血液生化指標(biāo)的影響 由表3 可知，各組對(duì)雞胚血液生化指標(biāo)的影響無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。但納米銅組較對(duì)照組、陰性對(duì)照組和硫酸銅組有降低雞胚血液膽固醇和甘油三酯含量的趨勢(shì)（P=0.07）。

2.3 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚組織器官相對(duì)重量的影響 由表4 可知，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，雞胚注射納米銅或硫酸銅對(duì)雞胚蛋黃、心臟、肝臟、小腸和胸肌重量的影響均無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。雞胚注射硫酸銅、納米銅或去離子水較對(duì)照組顯著提高了卵黃囊重量（P ＜0.05），納米銅組和陰性對(duì)照組較硫酸銅組顯著提高了卵黃囊重量（P ＜0.05），和100 mg/kg納米銅組相比，50 mg/kg 納米銅卵黃囊重量顯著提高4.3%（P ＜0.05），而50 和100 mg/kg 硫酸銅對(duì)雞胚卵黃囊重量的影響無(wú)顯著差異（P ＞0.05）。

表3 硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚血液生化指標(biāo)的影響

表4 硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚組織器官重量的影響 g

2.4 雞胚注射不同水平硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響 由表5 可知，與對(duì)照組和陰性對(duì)照組相比，雞胚注射納米銅或硫酸銅對(duì)雞胚核因子、腫瘤壞死因子α 和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平均無(wú)顯著影響（P ＞0.05）。但100 mg/kg 硫酸銅組較其他各組顯著提高了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平（P ＜0.05）。

3 討論

銅經(jīng)過(guò)納米級(jí)處理后對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能影響的機(jī)制還尚不清楚，有研究認(rèn)為，納米銅可以提高機(jī)體的抗菌能力，但也有報(bào)道指出，納米銅主要是通過(guò)改善機(jī)體對(duì)能量和脂肪的消化率來(lái)影響生長(zhǎng) 性 能（Usman 等，2013）。Pineda 等（2012）研究發(fā)現(xiàn)，納米級(jí)的銀離子可以運(yùn)輸氧氣，而納米銅是輸氧蛋白的主要成分，因此，作者假設(shè)雞胚體外注射納米銅可以提高氧氣的利用率。銅是血紅蛋白的重要組成部分，負(fù)責(zé)細(xì)胞氧氣的運(yùn)輸和一些重要酶如細(xì)胞色素c 氧化酶的活力，后者對(duì)細(xì)胞能量代謝極為重要。本試驗(yàn)研究了體外注射納米銅或硫酸銅對(duì)雞胚耗氧量和能量消耗量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞胚注射硫酸銅或納米銅較對(duì)照組和陰性對(duì)照組顯著提高了各日齡雞胚能量消耗，且納米銅的效果更為顯著，這與納米銅較硫酸銅的生物學(xué)利用率高，對(duì)血管形成和生長(zhǎng)的作用高于硫酸銅有關(guān)（Mroczek-Sosnowska 等，2015）。此外，納米銅由于顆粒粒度小，具有較高的表面積，因此具有特殊的物理化學(xué)活性和較強(qiáng)的穿透能力（Mamonova 等，2013）。

表5 硫酸銅和納米銅對(duì)雞胚發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)的影響

試驗(yàn)用卵黃囊和組織器官的重量評(píng)估胚胎的發(fā)育狀況，但結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雞胚注射硫酸銅、納米銅或去離子水較對(duì)照組顯著提高卵黃囊重量，但對(duì)其他組織器官的重量無(wú)顯著影響，這說(shuō)明硫酸銅或納米銅對(duì)雞胚代謝率的影響還未達(dá)到影響雞胚生長(zhǎng)發(fā)育的程度。50 mg/kg 納米銅提高了雞胚代謝率，這與Pineda 等（2012）的研究報(bào)道存在差異，這與不同品種的雞胚重量不同有關(guān)，蛋雞雞胚重量小于肉雞，代謝速度慢。肉雞生長(zhǎng)快速，其蛋黃較大，需要更多的能量用于生長(zhǎng)（Buzala 等，2015）。

本試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，體外注射硫酸銅或納米銅對(duì)血清生化指標(biāo)無(wú)顯著影響，納米銅較硫酸銅有降低甘油三酯和膽固醇的趨勢(shì)，說(shuō)明雞胚孵化前注射硫酸銅對(duì)雞胚孵化性能無(wú)顯著影響Mroczek-Sosnowska 等（2015）。雞胚注射硫酸銅或納米銅對(duì)肝臟免疫相關(guān)基因（核因子和腫瘤壞死因子）及胸肌生長(zhǎng)相關(guān)基因（血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A）的mRNA 相對(duì)表達(dá)量無(wú)顯著影響，但100 mg/kg硫酸銅組較其他各組顯著提高了成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2 基因的mRNA 相對(duì)表達(dá)水平，其原因可能是抗原呈遞細(xì)胞沒(méi)有在孵化的幼體中吸收納米銅離子，并且免疫刺激功能還不完善，同時(shí)Pineda等（2012）的研究結(jié)果也顯示雞胚注射50 mg/kg納米銅對(duì)抗炎因子也無(wú)顯著影響。

4 結(jié)論

雞胚體外注射50 mg/kg 納米銅可以促進(jìn)胚胎代謝速度，納米銅對(duì)雞胚具有免疫生物學(xué)相容性，對(duì)雞胚孵化無(wú)負(fù)面影響。