陸小林 林志偉 陳麗芳 鄭坤木 魯叢霞△

1)廈門大學(xué)醫(yī)學(xué)院，福建 廈門 361005 2)福建醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，福建 福州 350001 3)廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院，福建 廈門 361003

動脈粥樣硬化性腦梗死是因腦血管局部狹窄或血栓形成出現(xiàn)腦血液供應(yīng)障礙，局部腦組織缺血、缺氧性壞死而出現(xiàn)相應(yīng)的神經(jīng)功能缺損的一類臨床綜合征。腦梗死的發(fā)病率不斷增加[1-2]，動脈粥樣硬化是影響心腦血管病的重要危險因素，與年齡、飲食、生活習(xí)慣以及血脂、高血壓、糖尿病等相關(guān)。血脂的異常代謝是動脈粥樣斑塊形成的重要因素。因此，調(diào)節(jié)血脂、穩(wěn)定斑塊等治療對預(yù)防動脈粥樣硬化性腦梗死具有重要作用。人類載脂蛋白E是由肝臟、腦等組織器官合成的具有多種生物活性的蛋白質(zhì)[3]。早在1973年SHORE等[4]首先提出，人類載脂蛋白E是位于19號染色體上長臂13區(qū)2帶(19q13.2)上，在ApoAⅠ、ApoAⅣ、ApoCⅠ、ApoCⅡ、ApoCⅢ基因片段后，含有4個外顯子和3個內(nèi)含子。初始翻譯產(chǎn)物具有317個氨基多肽，與尾端有18個氨基N末端信號肽一起進入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，再轉(zhuǎn)移入高爾基體后經(jīng)過糖基化等作用后形成含有299個氨基酸的肽鏈。2011年，CHEN等[5]提出了代表野生型ApoE3的結(jié)構(gòu)。在NMR(磁共振)光譜[6]確定了ApoE的結(jié)構(gòu)及與功能間的關(guān)系。ApoE是由四條折疊反向平行的含有疏水性中心四條螺旋體束和親脂性表面形成細長球形螺旋梁形式。ApoE主要有3個等位基因E2、E3和E4，3種異性型ApoE2、ApoE3和ApoE4僅在位置112和(或)158處不同[7]。 ApoE3在112位為半胱氨酸，158位為精氨酸，ApoE2在112和158位均為半胱氨酸，ApoE4在112和158位均為精氨酸[8]。ApoE是血漿脂蛋白的重要組分，為脂質(zhì)轉(zhuǎn)運蛋白和低密度脂蛋白受體的主要配體。ApoE與血脂代謝關(guān)系的研究發(fā)現(xiàn)，ApoE2與Ⅲ型高脂血癥和早期動脈粥樣硬化有關(guān)，ApoE4與血漿LDL升高有關(guān)[9-10]。一項曼哈頓研究發(fā)現(xiàn)，ApoE4參與動脈粥樣硬化，與頸內(nèi)動脈厚度呈正相關(guān)，且不受人群種族差異影響[11]。關(guān)于ApoE基因多態(tài)性與冠心病(CHD)的研究已證明，ApoE基因型與LDL-C水平和冠狀動脈風(fēng)險之間存在線性關(guān)系。與E3/E3基因型的個體相比，E4攜帶者發(fā)生急性心血管事件增高。E2攜帶者冠心病的風(fēng)險降低[12-13]。但ApoE基因多態(tài)性與腦梗死風(fēng)險的相關(guān)性研究目前尚不清楚。歐洲的一項Meta分析[14]顯示，ApoE基因型與LDL-C、C-IMT和缺血性腦卒中呈正相關(guān)。同樣，對中國人群的研究也發(fā)現(xiàn)ApoE與缺血性腦梗死相關(guān)[15-17]。而關(guān)于缺血性腦梗死的全基因組的關(guān)聯(lián)研究并沒有發(fā)現(xiàn)ApoE基因變異。然而，因全基因組檢測在E2/E3/E4基因的不完整導(dǎo)致 E2/E3/E4基因型與缺血性腦梗死的關(guān)聯(lián)并不確定[18-19]。本研究主要通過研究ApoE基因與血脂、頸動脈粥樣硬化程度的相關(guān)性及進一步觀察ApoE基因多態(tài)性與動脈粥樣硬化性腦梗死的關(guān)系。

1 材料及方法

1．1研究對象160例研究對象來自廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的住院患者，其中缺血性腦卒中患者95例，非缺血性腦卒中患者65例。腦梗死組入選標準：(1)符合急性腦梗死診斷標準且影像學(xué)DWI上有新發(fā)腦梗死病灶；(2)患者為首次發(fā)現(xiàn)的腦梗死；(3)既往未曾使用過降脂藥物，或已停藥1 a以上；(4)根據(jù)TOAST分型，納入大動脈粥樣硬化型患者，排除心源性腦梗死患者和其他或不明原因的腦梗死患者。對照組入選標準：(1)既往無腦血管病變，神經(jīng)系統(tǒng)體格檢查陰性；(2)未使用過降脂藥物，或已停藥1 a以上。排除血管炎、嚴重肝腎功能不全、甲狀腺及血液系統(tǒng)疾病等患者。

1．2儀器和試劑Sequoia 512 超聲診斷儀，探頭頻率 5～8 MHz；ApoE基因檢測試劑盒(主要組成成分包括PCR緩沖液、dNTPs、特異性引物和探針、內(nèi)標引物和探針、Taq酶、UNG酶)購自武漢友芝友醫(yī)療科技股份有限公司。

1．3檢測指標

1．3．1 基因檢測指標及判定：取受試對象2 mL EDTA抗凝新鮮全血中提取的人類基因組DNA；—20 ℃以下保存。將待測樣本分別用4種PCR反應(yīng)液進行檢測。按照儀器相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)擴增曲線，劃定合適基線和熒光閾值，得到不同通道Ct值進行結(jié)果判定。同時進行弱陽性和空白對照。檢測結(jié)果的判定見表1。

1．3．2 頸動脈彩超檢測指標及判定：檢測頸動脈內(nèi)膜厚度(IMT)。IMT正常：頸總動脈或其分叉處IMT<1.0 mm；IMT增厚：1.0 mm≤頸總動脈或其分叉處IMT<1.5 mm；斑塊形成：任何一部位頸動脈IMT≥1.5 mm。將106例行頸動脈彩超的患者分為4組：正常組、增厚組、穩(wěn)定斑塊組、不穩(wěn)定斑塊組。穩(wěn)定斑塊組：表面光滑，50%以上斑塊區(qū)域呈均質(zhì)或強回聲，后方伴聲影。不穩(wěn)定斑塊組：表面不光滑，>50%的斑塊是異質(zhì)的，低和不規(guī)則的低回聲暗區(qū)或潰瘍斑塊。如果受試者同時具有穩(wěn)定和不穩(wěn)定的斑塊，則歸于不穩(wěn)定斑塊。所有超聲檢測結(jié)果均由2名超聲科專業(yè)醫(yī)師進行判定。

2 結(jié)果

2．1缺血性和非缺血性腦卒中基本資料比較95例缺血性腦卒中和65例非缺血性腦卒中患者基本資料比較見表2。缺血性腦卒中和非缺血性腦卒中患者高血壓和低密度脂蛋白等差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、0.042)，糖尿病、膽固醇、甘油三酯方面差別無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2．2 ApoE基因多態(tài)性與缺血性腦卒中的關(guān)系基因型分析顯示，見表3。2組均有E2/E3、E2/E4、E3/E3、E3/E4四種基因型，均無E2/E2、E4/E4基因型，2組ApoE基因型差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.035)。在缺血性腦卒中和非缺血性腦卒中組，與E2/E3基因型比較，E3/E3(OR=0.184，95%CI=0.040～0.845)，E3/E4(OR=0.124，95%CI=0.024～0.649)；E3/E3、E3/E4OR值<1，與E2/E3比較，說明E3/E3、E3/E4 是缺血性腦卒中的保護因素。

2．3缺血性腦卒中和非缺血性腦卒中組血脂和ApoE基因型比較TC、LDL-C、ApoB濃度在缺血性和非缺血性腦卒中組均為E3/E4>E3/E3>E2/E3；2組中LDL-C水平在基因型為E2/E3與E3/E4、E3/E3與E3/E4中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.016、0.017)，在E3/E4基因型中水平更高。2組中ApoB水平在基因型為E2/E3與E3/E4、E3/E3與E3/E4差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009、0.003)，在E3/E4基因型中水平更高。見表4。

表1 結(jié)果判定

表2 2組一般情況比較

2．4 2組頸動脈斑塊與血脂的關(guān)系2組中TC、TG的濃度為不穩(wěn)定斑塊>穩(wěn)定斑塊>增厚組>正常組；LDL-C、ApoB的濃度為穩(wěn)定斑塊>不穩(wěn)定斑塊>增厚組>正常組。LDL-C、ApoB在2組頸動脈斑塊中差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P=0.018、0.007)。與頸動脈正常組比較，LDL-C、ApoB在頸動脈穩(wěn)定斑塊組中含量更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P=0.004、0.002)。與頸動脈正常組比較，LDL-C、ApoB在頸動脈不穩(wěn)定斑塊組中含量更高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(分別為P=0.007、0.005)。HDL-C在2組頸動脈斑塊中差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.672)。見表5。

2．5 ApoE基因型與頸動脈硬化斑塊的關(guān)系將正常組和增厚組分為非斑塊組、穩(wěn)定斑塊組與不穩(wěn)定斑塊組分為斑塊組，ApoE基因型在2組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.026<0.05)，2組在基因型E2E3和E3E4間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.009)，與E2/E3基因型比較，E3/E4(OR=12.75，95%CI=1.840～88.352)，其OR值>1，說明ApoE基因型E3/E4較E2/E3與頸動脈粥樣硬化斑塊更相關(guān)。見表6。

表3 2組ApoE基因型分布 [n(%)]

表4 2組血脂脂蛋白與ApoE基因型比較

注：與E2/E3比較，*P<0.05；與E3/E3比較，△P<0.05

表5 2組頸動脈硬化斑塊與血脂的關(guān)系

注：與正常組比較，*P<0.05

表6 ApoE基因型與頸動脈硬化斑塊的關(guān)系

3 討論

大動脈粥樣硬化是缺血性腦卒中的常見原因[20]。頸動脈硬化斑塊是影響缺血性腦卒中的危險因素[21]。頸動脈斑塊表面纖維帽的連續(xù)性中斷、形成潰瘍，血小板黏附、聚集成血栓，血栓脫落是腦卒中的主要原因。LDL-C是動脈粥樣硬化發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵因素[22]；在血脂異常的不同類型中，LDL-C高水平與缺血性卒中復(fù)發(fā)相關(guān)[23]。本研究表明，與E2/E3比較，基因型E3/E3、E3/E4可能是動脈粥樣硬化性腦梗死的保護因素，與 ZHONG等[24]的研究一致。缺血性和非缺血性腦卒中血漿TC、LDL-C、ApoB含量均為E3/E4>E3/E3>E2/E3，2組血漿LDL-C水平在E3/E4與E2/E3、E3/E3中比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，與HAN[25]等觀察到的ApoE2等位基因攜帶者ApoE水平顯著升高，血清總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和載脂蛋白B(ApoB)水平降低一致。與動脈正常組比較，血脂LDL-C、ApoB在穩(wěn)定和不穩(wěn)定斑塊組中較高，說明LDL-C是形成動脈粥樣斑塊的危險因素；其他學(xué)者[26-27]關(guān)于LDL-C與頸動脈粥樣斑塊的研究也證實此結(jié)論。與無斑塊組比較，基因型E3/E4在有斑塊組中較基因型E2/E3組高；說明ApoE與頸動脈粥樣硬化斑塊的相關(guān)性可能是通過基因型E3/E4影響血脂LDL-C進一步造成頸動脈硬化和斑塊的形成。與其他學(xué)者[17，28]關(guān)于ApoE E3/E4與頸動脈斑塊相關(guān)的研究一致。但也有學(xué)者[29]發(fā)現(xiàn)，與E3組(E3/E3)患者相比，E2組(E2/E3)患者更常出現(xiàn)低回聲，潰瘍斑和嚴重狹窄。BARADARAN等[30]觀察發(fā)現(xiàn)的軟斑塊、潰瘍斑塊與同側(cè)腦血管缺血有關(guān)，說明ApoE可能通過其影響頸動脈粥樣硬化斑塊而與動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)[31-35]。本研究發(fā)現(xiàn)ApoE基因型E3/E4較E2/E3對缺血性腦卒中有保護作用。一項關(guān)于歐洲人群的大型薈萃分析說明，ApoE基因型與LDL-C、C-IMT和缺血性腦卒中呈劑量-反應(yīng)關(guān)聯(lián)[36-40]，可能與地區(qū)和種族之間的差異有關(guān)。ApoE基因型E3/E4與血脂LDL-C、動脈粥樣硬化程度相關(guān)，但是否與大動脈粥樣硬化性腦梗死相關(guān)需要后期進一步加大樣本量和多因素綜合分析。