王修成 王新軍 曾凡濤

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，河南 鄭州 450052

膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，約占顱內(nèi)惡性腫瘤的81%[1]。根據(jù)WHO分級系統(tǒng)，腦膠質(zhì)瘤分為四級，其中Ⅰ/Ⅱ級為低級別膠質(zhì)瘤，Ⅲ/Ⅳ為高級別膠質(zhì)瘤。目前，膠質(zhì)瘤的治療手段多以手術(shù)切除+術(shù)后放化療為主，手術(shù)切除范圍及放化療程度、是否復(fù)發(fā)與患者預(yù)后相關(guān)[2-8]，并且術(shù)中皮層電生理檢測及清醒開顱手術(shù)等技術(shù)已在許多醫(yī)院開展[9-11]。替莫唑胺及干擾素等化療藥物的積極應(yīng)用[12-15]，對膠質(zhì)瘤的綜合治療已足夠積極，但由于膠質(zhì)瘤浸潤性生長的生物學(xué)特性使其切除干凈難度加大[16]，預(yù)后效果并不理想。除少數(shù)低級別膠質(zhì)瘤(如毛細(xì)胞星形細(xì)胞瘤)可以通過積極手術(shù)治療，預(yù)后較好以外，大部分膠質(zhì)瘤患者接受多種治療手段治療后仍復(fù)發(fā)(膠質(zhì)母細(xì)胞瘤等)，平均生存期只有1 a。據(jù)文獻報道，其5 a生存期<9.8%[17-19]。近年來膠質(zhì)瘤發(fā)病率呈上升趨勢，所以對膠質(zhì)瘤的診治顯得尤為重要。

異檸檬酸脫氫酶(IDH)是三羧酸循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，其在生物的能量代謝及生物合成/抗氧化等方面具有重要作用，所以其結(jié)構(gòu)及生理活性的改變可直接影響整個三羧酸循環(huán)，進而可導(dǎo)致機體的正常代謝改變。目前已知IDH1的基因突變與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展有一定關(guān)系[20-25]，而目前IDH1的表達情況與膠質(zhì)瘤及相關(guān)因素之間的關(guān)系研究較少。本文探討膠質(zhì)瘤中IDH1的表達及其相關(guān)因素，為膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展等進一步探索提供依據(jù)。

1 資料與方法

1．1一般資料收集鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院2015-01—2017-05手術(shù)切除經(jīng)病理確診的92例腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本，按病理分級分成2組：低級別組(Ⅰ/Ⅱ)60例，高級別組(Ⅲ/Ⅳ)32例，其中星形膠質(zhì)細(xì)胞瘤44例，少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤24例，星形-少突膠質(zhì)細(xì)胞瘤12例，膠質(zhì)母細(xì)胞瘤12例；男44例，女48例；年齡1～75歲，平均42.9歲，青少年(7～40歲)30例，中年(41～65歲)52例，老年(>65歲)10例。取同期因顱腦外傷行“開顱減壓術(shù)”獲取的正常腦組織20例。

1．2實驗材料兔IDH1多克隆抗體(型號為K003272P)購自北京索萊寶公司，山羊血清封閉液購自北京索萊寶公司，羊抗兔二抗試劑盒及DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶公司，過氧化氫酶阻斷劑購自北京索萊寶公司。

1．3實驗方法手工免疫組化染色檢測IDH1的步驟：常規(guī)石蠟包埋組織，切片厚度3 μm，60度烤箱中烤片1 h，常規(guī)脫臘、脫水后用pH 6.0檸檬酸鈉120 ℃的條件下進行抗原修復(fù)2.5min。室溫條件下3%過氧化氫阻斷內(nèi)源性過氧化物酶10 min，山羊血清封閉恒溫箱內(nèi)15 min，PBS洗3遍/3 min，加入1抗(1：50)4 ℃冰箱過夜，加入2抗(1：100)37 ℃恒溫箱孵育0.5 h，DAB顯色，并在顯微鏡下觀察顯色程度，待出現(xiàn)淺棕色本底時及時終止，時間為1.5 min。蘇木素復(fù)染，清水反藍，依次水化脫臘，中性樹膠封片。取已證實的膠質(zhì)瘤切片一抗加IgG作為陰性對照，另取已證實的膠質(zhì)瘤切片一抗加PBS作為空白對照。

IDH1在胞核和胞質(zhì)均有表達，因此可通過胞核和胞質(zhì)內(nèi)棕褐色及棕黃色等判斷陽性細(xì)胞，結(jié)果按陽性細(xì)胞百分比和顯色程度綜合評分。(1)陽性著色細(xì)胞數(shù)，每張切片觀察5個高倍視野，計數(shù)陽性細(xì)胞百分比，陽性細(xì)胞數(shù)<5%為0分，5%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～75%為3分，76%～100%為4分。(2)陽性著色強度：無色為零分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。(3)兩者相乘即為陽性等級：0分為陰性(-)，1～4為弱陽性(+)，5～8分為陽性(++)，9～12分為強陽性(+++)。

1．4統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計學(xué)處理，不同病理級別、性別、年齡中IDH1表達程度比較用χ2檢驗。不同類別膠質(zhì)瘤及膠質(zhì)瘤患者有無伴發(fā)癲癇中IDH1表達程度比較用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

膠質(zhì)瘤中IDH1的表達程度與臨床因素之間的關(guān)系：膠質(zhì)瘤中IDH1的表達程度與病理級別(χ2=11.25，P=0.000 8)、年齡(χ2=7.224，P=0.027)及是否伴發(fā)癲癇(χ2=4.147，P=0.014 71)具有相關(guān)性。與性別(χ2=0.046，P=0.83)及病理分型無相關(guān)性(χ2=6.74，P=0.080 66)。見表1、圖1。

3 討論

自從發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤與IDH1的關(guān)系以來，關(guān)于兩者之間的研究越來越多。目前已經(jīng)證實IDH1的突變在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展中有重要作用[26-30]。IDH1突變型已可作為膠質(zhì)瘤常規(guī)檢查指標(biāo)，而對于IDH1在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的表達情況與膠質(zhì)瘤本身的發(fā)生、發(fā)展目前研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，IDH1的表達程度與膠質(zhì)瘤的病理分級、是否伴發(fā)癲癇及發(fā)病年齡具有相關(guān)性，進而可為膠質(zhì)瘤的早期發(fā)現(xiàn)、診斷等方面提供一定依據(jù)。

本試驗發(fā)現(xiàn)，IDH1的表達程度與病理分級具有相關(guān)性，可能因膠質(zhì)瘤的惡性程度較高，細(xì)胞分化不完全，增殖活躍，引起IDH1的表達程度增高。對判斷膠質(zhì)瘤的級別有一定指導(dǎo)意義。在低級別膠質(zhì)瘤中12例出現(xiàn)高表達，其中一級4例，二級8例。一級患者中3例年齡<10歲，了解其相關(guān)病史未見明確誘因，考慮可能存在導(dǎo)致患者在年齡較小出現(xiàn)IDH1的高表達的因素，可能提示患者預(yù)后不良，需進一步觀察，也可能由于免疫組化染色技術(shù)的誤差導(dǎo)致。高級別膠質(zhì)瘤中12例中出現(xiàn)低表達，其中3級8例，4級4例，可能在高級別膠質(zhì)瘤中存在抑制IDH1表達的未知原因，也從一定程度上說明膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是多因素共同作用導(dǎo)致的結(jié)果[31-33]。

表1 膠質(zhì)瘤中IDH1的表達程度與病理級別、性別、年齡、是否伴發(fā)癲癇、病例分型的關(guān)系

目前已知癲癇與膠質(zhì)瘤的級別有相關(guān)性。低級別的膠質(zhì)瘤癲癇發(fā)生率較高，常需要積極治療[34-37]。對膠質(zhì)瘤合并癲癇患者中IDH1的表達程度研究發(fā)現(xiàn)兩者之間具有相關(guān)性，即合并癲癇患者腦細(xì)胞中IDH1的表達程度較未合并癲癇患者低，查閱患者病例資料發(fā)現(xiàn)，合并癲癇的多數(shù)為低級別膠質(zhì)瘤，與前面所述符合?？赡躀DH1的表達與癲癇之間具有潛在的相互作用，可通過觀察膠質(zhì)瘤中IDH1表達程度的高低預(yù)測患者發(fā)生癲癇的風(fēng)險大小，具有一定的指導(dǎo)意義。

不同年齡段之間的IDH1表達程度對比差異有統(tǒng)計學(xué)意義，且在青少年和老年中IDH1高表達所占比例高，中年IDH1高表達所占比例較低，回顧病例資料發(fā)現(xiàn)，中年患者數(shù)量最多，并且低級別患者占多數(shù)，導(dǎo)致不同年齡段患者之間IDH1的表達程度出現(xiàn)差異。

膠質(zhì)瘤作為威脅人類健康的惡性腫瘤之一，發(fā)病有上升趨勢，環(huán)境惡化及現(xiàn)代人生活、飲食的變化及電離輻射[38-42]可能為膠質(zhì)瘤發(fā)展的部分原因。所以膠質(zhì)瘤的診斷治療亟待解決，雖然目前已發(fā)現(xiàn)IDH1突變、HMGB1、TLR4、ERCC、VEGF、TGF、MicroRNA等因素與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展有一定關(guān)系[43-47]，但對于膠質(zhì)瘤的早期發(fā)現(xiàn)診斷仍無特異性標(biāo)志物。本研究顯示，IDH1的表達程度與病理級別有相關(guān)性，可能為膠質(zhì)瘤的早期診斷提供依據(jù)，具有一定的指導(dǎo)意義。后期將致力于研究癌灶和癌旁之間IDH1表達程度是否存在差異，希望為癌癥細(xì)胞早期的遷移及轉(zhuǎn)移的研究有所發(fā)現(xiàn)。同時也將探索導(dǎo)致患者在年齡較小出現(xiàn)高表達的原因及導(dǎo)致高級別出現(xiàn)低表達的因素，以及DH1表達與癲癇之間是否存在潛在聯(lián)系，為膠質(zhì)瘤的研究提供一定的思路和方向。

Figure1IDH1immunohistochemicalstaininginnormalbraintissues，epileptogenicfocustissuesandgliomatissues(×400，scale=50μm)A：negativeinnormalbraintissues；B：IDH1stainingingliomawithepilepsytissues(Ⅰ)；C：IDH1stainingingliomawithepilepsytissues(Ⅱ)；D：IDH1stainingingliomawithoutepilepsytissues(Ⅲ)；E：IDH1stainingingliomawithoutepilepsytissue(Ⅳ)