秦 濤 王志龍 廉洪宇 馬遇伯△

牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院 1)骨外二科 2)研究生培養(yǎng)科，黑龍江 牡丹江 157011

周圍神經(jīng)缺損的修復(fù)一直是臨床上較為棘手的難題。近年來應(yīng)用神經(jīng)營養(yǎng)因子聯(lián)合種子細(xì)胞治療被認(rèn)為是促進(jìn)周圍神經(jīng)再生的重要方法[1-3]。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brain derived neurotrophic factor，BDNF)作為重要神經(jīng)營養(yǎng)因子，對(duì)于中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)軸突再生和神經(jīng)元存活和有顯著促進(jìn)作用，但直接對(duì)患者應(yīng)用BDNF治療面臨許多困難。BDNF口服會(huì)被消化酶分解，且BDNF的半衰期很短(大鼠血漿內(nèi)≤1 min)，穿過血腦屏障能力很差，直接將BDNF注射到腦室對(duì)大腦實(shí)質(zhì)內(nèi)滲透的能力弱?？挂钟羲幈蛔C明能夠增加BDNF的作用能力，但其有較長延遲期，療效低，且有不良反應(yīng)[4-6]。最新發(fā)現(xiàn)的小分子的黃酮類化合物7，8-二羥基黃酮(7，8-dihydroxyflavone，7，8-DHF)作為一種BDNF小分子化合物，是一種強(qiáng)力的TrkB受體激活劑。與BDNF比較，7，8-DHF具有能通過血腦屏障、免疫反應(yīng)或不良反應(yīng)少、半衰期較長等優(yōu)點(diǎn)[7-9]。最新研究表明7，8-DHF可高效安全激活BDNF/酪氨酸激酶B (TrkB) 通路，促進(jìn)周圍神經(jīng)軸突再生[10]。但目前7，8-DHF聯(lián)合種子細(xì)胞修復(fù)周圍神經(jīng)損傷的研究尚未見報(bào)道。

本研究探討7，8-DHF聯(lián)合施萬細(xì)胞(Schwann cells，SCs)是否能夠協(xié)同促進(jìn)周圍神經(jīng)損傷后軸突再生。通過構(gòu)建大鼠坐骨神經(jīng)缺損模型，將7，8-DHF聯(lián)合SCs種植到脫細(xì)胞神經(jīng)移植物(acellular nerve allograft，ANA)修復(fù)周圍神經(jīng)損傷，檢測髓鞘生成、軸突再生及功能重建情況，為神經(jīng)損傷提供新的聯(lián)合治療策略。

1 材料和方法

1．1 SCs細(xì)胞培養(yǎng)按前期方法取大鼠坐骨神經(jīng)進(jìn)行SCs細(xì)胞分離和原代培養(yǎng)[1]，取SCs染色[11]PKH26(Sigma公司，美國)。

1．2動(dòng)物分組Sprague Dawley(S-D)成年大鼠45只，體質(zhì)量(200±20)g，(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(黑)203-001)。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為：(1)ANA組：取大鼠坐骨神經(jīng)應(yīng)用化學(xué)萃取脫細(xì)胞法[12]制備ANA，在ANA注50 μL PBS，橋接5 mm坐骨神經(jīng)缺損；(2)SCs組：在ANA注入50 μL 被PKH26染色的SCs(2×106個(gè))；(3)7，8-DHF + SCs組：PKH26染色SCs(2×106個(gè)/50 μL)聯(lián)合7，8-DHF(10% DMSO，5 mg/kg，購于Tokyo Chemi-cal Industry Co)注入ANA[12]。每組15只，術(shù)后28 d麻醉取材，用于免疫熒光染色檢測10只，Western bolt檢測5只。

1．3 SFI檢測參照前期研究方法行坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI)檢測[12]，術(shù)后28 d檢測大鼠足印，檢測中間足趾寬度( istance between intermediate toes or intermediary toe spread，ITS)、足印長度(podogram length，PL)。SFI=-38.3[(EPL-NPL)/NPL]+109.5[(ETS-NTS)/NTS]+13.3[(EIT-NIT)/NIT]-8.8。

1．4電生理檢測采用誘發(fā)電位儀(Magstim公司，英國)進(jìn)行經(jīng)顱磁刺激(transcranial magnetic motor evoked potentials，tcMMEP)檢測，記錄神經(jīng)電生理指標(biāo)。

1．5免疫熒光染色將取各組神經(jīng)組織行常規(guī)免疫熒光染色，加入兔抗大鼠NF抗體(sigma公司，美國)，濃度1：200，4 ℃過夜，加入羊抗兔IgG(FITC)(sigma公司，美國)，濃度1：200，室溫孵育1 h，檢測光密度(IOD)值及PKH26染色SCs。

1．6 Western bolt檢測應(yīng)用bicinchoninicacid試劑盒(Beyotime Biotechnology公司)進(jìn)行裂解和蛋白質(zhì)濃度檢測。轉(zhuǎn)移到PVDF膜，封閉后加兔抗大鼠BDNF(濃度1：200，Sigma公司，美國)、兔抗大鼠TrkB(濃度1：200，Sigma公司，美國)和GADPH(1：5 000)，二抗(1：2 000)孵育2 h，TBS洗凈，應(yīng)用顯色液顯示后行吸光度檢測。

2 結(jié)果

2．1 SCs培養(yǎng)原代培養(yǎng)SCs 8 d和12 d后 SCs呈為梭形或三角形胞體，細(xì)胞貼壁良好(圖1) 。

2．2免疫熒光染色觀察結(jié)果鏡下可見7，8-DHF + SCs組和SCs組ANA中段有PKH26標(biāo)記的移植SCs，ANA組未見PKH26標(biāo)記的SCs，其中7，8-DHF+SCs組(574.4±46.25)PKH26陽性表達(dá)顯著高于SCs組(162.1±55.72) (F2，12=103.7，P<0.001)。應(yīng)用S100免疫熒光標(biāo)記ANA中髓鞘生成情況，7，8-DHF + SCs組(2108±250.6)和SCs組(1124±189.6)ANA中段S100蛋白表達(dá)顯著高于ANA組(496.2±46.88)，且7，8-DHF + SCs組S100蛋白表達(dá)高于SCs組(F2，12=78.50，P<0.001，圖2)。

應(yīng)用NF免疫熒光標(biāo)記ANA軸突再生情況，檢測發(fā)現(xiàn)7，8-DHF + SCs組(2308±318.4)和SCs組(1314±196.6)ANA中段NF蛋白表達(dá)顯著高于ANA組(502.5±144.2)，且7，8-DHF + SCs組NF蛋白表達(dá)高于SCs組(F2，12=60.99，P<0.001，圖3)。

2．3 Western bolt檢測結(jié)果與ANA組比較，SCs組和7，8-DHF + SCs組BDNF和TrkB表達(dá)顯著增高(BDNF：F2，12=101.2，P<0.001；TrkB；F2，12=85.63，P<0.001)，其中7，8-DHF + SCs組BDNF和TrkB表達(dá)較SCs組顯著增高(圖4)。

2．4 SFI檢測結(jié)果術(shù)后28 d，與ANA組(-80.86±6.749)比較，7，8-DHF + SCs組(-41.19±5.418)和SCs組(-58.30±6.279)SFI指標(biāo)顯著增高，其中7，8-DHF + SCs組SFI指標(biāo)高于SCs組(F2，27=41.54，P<0.001，圖5)。

圖1 SCs原代培養(yǎng)8 d(A)和12 d(B)，標(biāo)尺=100 μmFigure 1 Primary culture of SCs 8d (A) and 12d (B)，scale=100 μm

圖2 各組ANA中段PKH26和S100免疫組化熒光染色(A)，PKH26和S100的IOD值(B～C)，標(biāo)尺=100 μm，n=10Figure 2 Immunohistochemical staining of PKH26 and S100 in the middle of each group of ANA (A)，IOD value of PKH26 and S100 (B-C)，scale=100 μm，n=10

圖3 各組ANA中段免疫熒光染色，NF標(biāo)記軸突再生(A)，IOD值檢測(B)，標(biāo)尺=100 μm，n=10Figure 3 NF immunohistochemical staining for axon regeneration in each group of ANA (A)，IOD value of NF (B)，scale=100 μm，n=10

圖4 Western bolt檢測各組BDNF和TrkB 蛋白相對(duì)表達(dá)， **P<0.01，***P<0.001，n=5Figure 4 Western bolt detection of relative expression of BDNF and TrkB proteins in each group，**P<0.01，***P<0.001，n=5

2．5神經(jīng)電生理檢測結(jié)果SCs組和7，8-DHF + SCs組神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅較ANA組顯著增加(神經(jīng)傳導(dǎo)速度：F2，15=62.31，P<0.05；延遲期：F2，15=25.52，P<0.05)，而延遲期較ANA組縮短(波幅：F2，15=28.43，P<0.05)，其中7，8-DHF + SCs組神經(jīng)電生理參數(shù)改善優(yōu)于SCs組(表1)。

圖5 坐骨神經(jīng)功能指數(shù)試驗(yàn)(n=10)，***P<0.001Figure 5 Sciatic nerve function index experiment (n=10)，***P<0.001

組別n神經(jīng)傳導(dǎo)速度 (m/s)延遲期(ms)波幅(mm)ANA組107.11±0.621.82 ± 0.272.25 ± 0.26SCs組108.96±0.55*1.36 ±0.28*2.94± 0.32*7,8DHF+ SCs組1010.65±0.59*#1.10± 0.22*#3.56 ± 0.38*#

注：與ANA組比較，*P<0.05；與SCs組比較，#P<0.05

3 討論

周圍神經(jīng)損傷修復(fù)是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過程。損傷部位神經(jīng)再生微環(huán)境的重建對(duì)組織再生和功能恢復(fù)發(fā)揮至關(guān)重要的作用。研究[9，11，13-14]證實(shí)脫細(xì)胞神經(jīng)移植物(ANA)為周圍神經(jīng)損傷能夠提供適宜軸突生長通路，被認(rèn)為是修復(fù)長距離神經(jīng)缺損的良好的移植物。

SCs作為神經(jīng)再生的重要種子細(xì)胞之一，其能夠分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子、細(xì)胞外基質(zhì)分子和黏附分子，促進(jìn)軸突生長。與其他類型細(xì)胞移植比較，SCs主要的優(yōu)勢(shì)[15-17]在于將再生的軸突髓鞘化。如果再生軸突不出現(xiàn)髓鞘化，新神經(jīng)環(huán)路的功能將嚴(yán)重受損，類似于臨床多發(fā)性硬化等癥狀。研究表明坐骨神經(jīng)損傷后SCs表型改變。SCs通過增殖和遷移形成Buengner帶，指導(dǎo)軸突生長到靶組織[18-20]。本研究應(yīng)用電生理和SFI檢測也再次證實(shí)種子細(xì)胞SCs能夠促進(jìn)坐骨神經(jīng)損傷后功能恢復(fù)。

大量研究證實(shí)[21-24]，聯(lián)合治療能夠克服多種抑制神經(jīng)軸突再生的因素，較單一治療效果更為明顯。應(yīng)用BDNF激活TrkB信號(hào)通路治療各種神經(jīng)系統(tǒng)疾病已成為今后的發(fā)展方向。然而直接給予患者神經(jīng)營養(yǎng)因子面臨許多障礙[25-26]。如口服會(huì)被消化酶分解、半衰期短、穿過血腦屏障能力差等[27-28]，因此BDNF在治療應(yīng)用上有很大的局限性。最近發(fā)現(xiàn)小分子黃酮類化合物7，8-DHF，其作為BDNF的小分子化合物，通過激活BDNF/TrkB信號(hào)通路發(fā)揮作用，可能會(huì)解決BDNF的局限性[4-6]：(1)與BDNF功能相似；(2)能通過血腦屏障，能通過血管或者腹腔注射；(3)減少免疫反應(yīng)或不良反應(yīng)；(4)半衰期較長。7，8-DHF可以跨越血腦屏障，特異性結(jié)合TrkB，導(dǎo)致磷酸化和二聚化，并在體內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用，已成為一個(gè)潛在有效的臨床治療手段。7，8-DHF自發(fā)現(xiàn)以來，短時(shí)間內(nèi)已證明其在體內(nèi)和體外對(duì)神經(jīng)損傷具有多重保護(hù)作用，研究發(fā)現(xiàn)，7，8-DHF能夠治療阿爾茨海默病模型小鼠認(rèn)知功能障礙、增強(qiáng)情緒記憶和預(yù)防大鼠應(yīng)激引起的記憶障礙、保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的細(xì)胞DNA損傷、保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷模型[29-30]。目前，7，8-DHF主要應(yīng)用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷，而應(yīng)用7，8-DHF治療周圍神經(jīng)缺損尚未見報(bào)道。本研究證實(shí)，術(shù)后4周與SCs組比較，7，8-DHF+SCs組BDNF及其受體TrkB蛋白在ANA內(nèi)表達(dá)顯著增高，證實(shí)7，8-DHF治療能夠有效調(diào)控ANA內(nèi)BDNF/TrkB信號(hào)表達(dá)，調(diào)節(jié)神經(jīng)再生微環(huán)境。

本研究還發(fā)現(xiàn)，7，8-DHF+SCs組PKH26染色細(xì)胞數(shù)量、NF和S100表達(dá)均高于SCs組，在行為學(xué)檢測方面，7，8-DHF + SCs組電生理參數(shù)和SFI改善均優(yōu)于SCs組，推測7，8-DHF可能通過調(diào)控BDNF表達(dá)，促進(jìn)種子細(xì)胞SCs增殖和存活，進(jìn)而改善周圍神經(jīng)損傷后運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)。

本研究證實(shí)了7，8-DHF聯(lián)合SCs能夠促進(jìn)大鼠周圍神經(jīng)損傷后軸突再生和運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)，其機(jī)制可能與7，8-DHF調(diào)控BDNF表達(dá)，促進(jìn)移植種子細(xì)胞SCs增殖和存活有關(guān)。