葉 巖，霍前倫，寧成棟

（六安市人民醫(yī)院心胸外科，安徽 六安 237016）

相關(guān)的調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，在所有惡性腫瘤患者中，肺癌患者的發(fā)病率和死亡率均最高。進(jìn)行外科手術(shù)是目前臨床上治療肺癌的主要手段。但是，TNM分期為I期且無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者在接受開胸肺癌根治術(shù)或腔鏡下肺癌完全性切除術(shù)后，仍有25%～30%的患者會(huì)出現(xiàn)病情復(fù)發(fā)的情況[1]。因此，對(duì)肺癌的侵襲機(jī)制和轉(zhuǎn)移機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的研究，尋找診斷及治療肺癌的有效靶點(diǎn)，對(duì)改善肺癌患者的預(yù)后具有重大意義。miR-135b（微小RNA-135b）是一類非編碼的、長度為19～22 nt的小分子RNA。目前，已發(fā)現(xiàn)miR-135b可參與機(jī)體的多種生理及病理活動(dòng)，包括惡性腫瘤的發(fā)生與發(fā)展[2]。有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，潛在的抑癌基因LZTS1（亮氨酸拉鏈腫瘤抑制基因1）在肺癌組織中存在異常表達(dá)的情況。本次研究主要是探討miR-135b和LZTS1在肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

本次研究的對(duì)象為2014年3月至2017年6月期間81例原發(fā)性肺癌患者在六安市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)治療時(shí)切取的81對(duì)肺癌組織及癌旁組織的存檔組織蠟塊標(biāo)本。本研究中患者的納入標(biāo)準(zhǔn)是：1）患者的病情經(jīng)病理檢查后，被確診為原發(fā)性肺癌。2）患者的臨床病例資料完整。3）患者的組織蠟塊標(biāo)本保存完好。其排除標(biāo)準(zhǔn)是：1）患者合并有其他惡性腫瘤。2）患者合并有可影響對(duì)其組織標(biāo)本進(jìn)行染色的嚴(yán)重疾病。在這81例患者中，有男性52例，女性29例；其中年齡＜60歲的患者有37例，年齡≥60歲的患者有44例；其中肺鱗癌患者有50例，肺腺癌患者有31例；其中肺癌分化程度為高分化的患者、為中分化的患者和為低分化的患者分別有35例、41例和5例；其中TNM分期為Ⅰ期的患者、為ⅡA期的患者、為ⅡB期的患者和為Ⅲ期的患者分別有3例、49例、21例和8例；其中無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有26例，出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者有55例。本次研究獲得了六安市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2 研究方法

對(duì)這81對(duì)組織蠟塊標(biāo)本均進(jìn)行miR-135b和LZTS1檢測，方法是：1）使用LNA-ISH法檢測組織標(biāo)本中miR-135b的表達(dá)。對(duì)組織蠟塊標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)的切片、烤片、脫蠟、水化處理后，加入蛋白酶K緩沖溶液以暴露其中的RNA，用PBS溶液洗滌2次，每次洗30 s，用甲醛固定后將其切片，再用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。將處理后的組織標(biāo)本放入55℃的雜交緩沖液中預(yù)孵育2 h，加入含探針（由丹麥的EXIQON公司定制合成）的雜交緩沖液后將其放入55℃的恒溫水浴箱中孵育過夜。對(duì)孵育后的組織標(biāo)本進(jìn)行洗滌后將其切片，然后使用NBT/BCIP法對(duì)切片進(jìn)行顯色，并用核固紅染液對(duì)切片進(jìn)行復(fù)染。對(duì)染色后的切片進(jìn)行常規(guī)梯度酒精脫水和中性樹膠封片。2）使用免疫組化法檢測組織蠟塊標(biāo)本中LZTS1蛋白的表達(dá)。對(duì)組織蠟塊標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)的切片、烤片、脫蠟、水化處理后，將其放入枸櫞酸鹽抗原修復(fù)液中進(jìn)行高溫高壓修復(fù)抗原4 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min，滴加H2O2覆蓋切片（以阻斷內(nèi)源性過氧化物酶），用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。將切片放入封閉用山羊血清（通用型SP試劑盒試劑A）中進(jìn)行室溫孵育30 min，滴加一抗LZTS1兔抗人多克隆抗體后在4℃的溫度下孵育過夜，將其滴加二抗生物素工作液（通用型SP試劑盒試劑B）后在常溫下孵育30 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。在切片中滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液（通用型SP試劑盒試劑C），將其在37℃的溫度下孵育30 min，用PBS溶液洗滌2次，每次洗5 min。用DAB顯色液對(duì)切片進(jìn)行顯色后，用蘇木素對(duì)其進(jìn)行復(fù)染，然后用自來水對(duì)其進(jìn)行沖洗反藍(lán)處理。對(duì)染色后的切片進(jìn)行常規(guī)的梯度酒精脫水和中性樹膠封片。3）對(duì)切片的染色結(jié)果進(jìn)行判定的方法是：在高倍光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野對(duì)切片進(jìn)行觀察。每個(gè)視野至少含有100個(gè)細(xì)胞，miR-135b以藍(lán)色或藍(lán)紫色顆粒為陽性信號(hào)，LZTS1以黃色或黃棕色顆粒為陽性信號(hào)。對(duì)切片染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分的標(biāo)準(zhǔn)是：⑴染色強(qiáng)度的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)是：無染色計(jì)為0分，淺色計(jì)為1分，淺色至中等染色計(jì)為2分，深度染色計(jì)為3分。⑵染色數(shù)目的計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)是：染色細(xì)胞數(shù)＜5%計(jì)為0分，染色細(xì)胞數(shù)為5%～25%計(jì)為1分，染色細(xì)胞數(shù)為26%～50%計(jì)為2分，染色細(xì)胞數(shù)為51%～75%計(jì)為3分，染色細(xì)胞數(shù)＞75%計(jì)為4分。各視野染色的評(píng)分＝染色強(qiáng)度計(jì)分×染色數(shù)目計(jì)分，將各視野評(píng)分的算術(shù)平均數(shù)作為最終評(píng)分。評(píng)分≤2分視為陰性表達(dá)，評(píng)分＞2分則視為陽性表達(dá)。然后，對(duì)這81對(duì)標(biāo)本的檢測結(jié)果和標(biāo)本所涉及患者的臨床資料進(jìn)行回顧性研究，從中找出肺癌組織中的miR-135b表達(dá)和LZTS1表達(dá)與患者臨床特征的相關(guān)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

將本次研究中的數(shù)據(jù)錄入到SPSS22.0軟件中進(jìn)行處理，計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)采用Spearman等級(jí)檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺癌組織標(biāo)本與肺癌旁組織標(biāo)本中miR-135b和LZTS1的陽性表達(dá)率

在本研究的81對(duì)組織標(biāo)本中，肺癌組織標(biāo)本中miR-135b的陽性表達(dá)率為66.67%（54/81），癌旁組織標(biāo)本中的miR-135b的陽性表達(dá)率為40.74%(33/81)；肺癌組織標(biāo)本中miR-135b的陽性表達(dá)率高于癌旁組織標(biāo)本中的miR-135b的陽性表達(dá)率，P＜0.05。肺癌組織標(biāo)本中LZTS1的陽性表達(dá)率為37.04%（30/81），癌旁組織標(biāo)本中LZTS1的陽性表達(dá)率為66.67%（54/81）；肺癌組織標(biāo)本中LZTS1的陽性表達(dá)率低于癌旁組織標(biāo)本中LZTS1的陽性表達(dá)率，P＜0.05。

2.2 肺癌患者的臨床特征與其肺癌組織中miR-135b的表達(dá)和LZTS1的表達(dá)的關(guān)系

在這81例患者中，肺癌組織的病理分化程度、TNM分期和是否出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移與其肺癌組織中miR-135b的陽性表達(dá)和LZTS1的陽性表達(dá)均密切相關(guān)，P＜0.05。詳見表1。

表1 肺癌患者的臨床特征與其肺癌組織中miR-135b的表達(dá)和LZTS1的表達(dá)的關(guān)系[n(%)]

2.3 肺癌組織標(biāo)本中miR-135b的陽性表達(dá)與其中LZTS1的陽性表達(dá)之間的關(guān)系

對(duì)這81對(duì)肺癌組織標(biāo)本的檢查結(jié)果進(jìn)行Spearman等級(jí)檢驗(yàn)的結(jié)果顯示，肺癌組織標(biāo)本中miR-135b的表達(dá)與LZTS1 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.651，P=0.000）。

3 討論

近年來，隨著分子檢測技術(shù)的逐漸成熟，研究人員對(duì)microRNAs等基因功能的研究也逐漸深入。microRNAs雖然屬于不編碼蛋白質(zhì)，但其可通過與靶基因mRNA 的3’UTR互補(bǔ)配對(duì)抑制蛋白質(zhì)的翻譯功能或直接降解mRNA，起到對(duì)靶基因的負(fù)性調(diào)控功能。microRNAs可廣泛地參與機(jī)體細(xì)胞的各種生理進(jìn)程（包括細(xì)胞的增殖、凋亡、分化與發(fā)育）。有研究表明，肺癌的發(fā)生、惡性進(jìn)展的過程均與microRNAs的異常表達(dá)密切相關(guān)[3]。miR-135b是近期內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的一種促癌基因。IS Fetahu等[4]的研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b能夠與miR-146b協(xié)同抑制鈣敏感受體，促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞的增殖，抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞的分化，增加結(jié)腸癌細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞的侵襲力。張學(xué)軍等[5]的研究發(fā)現(xiàn)，長鏈非編碼RNA GAS5對(duì)非小細(xì)胞肺癌的抗腫瘤作用是抑制肺癌組織中miR-135b的表達(dá)，增加癌細(xì)胞對(duì)放療的敏感性，抑制癌細(xì)胞的代謝，進(jìn)而起到抑癌基因樣作用。黃媛[6]的研究發(fā)現(xiàn)，在人體黏液樣脂肪肉瘤中miR-135b的表達(dá)上升，具有促進(jìn)腫瘤惡性進(jìn)展的作用。本研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b在肺癌組織標(biāo)本中呈異常高表達(dá)狀態(tài)，而且miR-135b的表達(dá)情況與患者肺癌組織的分化程度、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等均密切相關(guān)。這說明，miR-135b在肺癌組織中同樣呈現(xiàn)出促癌基因樣作用，并且可能參與抑制癌細(xì)胞分化及促進(jìn)癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移等過程。LZTS1是Ishii等在1999年由8p22基因克隆出的一種抑癌基因。大量的研究表明，LZTS1可表現(xiàn)出抑癌基因樣作用。阮國棟[7]的研究表明，多種胃癌細(xì)胞中LZTS1的表達(dá)異常降低，而且缺失LZTS1的胃癌細(xì)胞可呈現(xiàn)出低分化、高侵襲力的傾向。Ishii等[8]的研究結(jié)果顯示，LZTS1對(duì)腫瘤細(xì)胞的抑制作用是通過調(diào)控細(xì)胞的有絲分裂來實(shí)現(xiàn)的。周薇[9]的研究發(fā)現(xiàn)，LZTS1可通過抑制AKT-mTOR的信號(hào)通路抑制結(jié)腸癌細(xì)胞和直腸癌細(xì)胞的增殖與分化。李偉東等[10]的研究發(fā)現(xiàn)，通過乳腺癌組織中LZTS1的表達(dá)缺失可推測出乳腺癌的發(fā)生可能與LZTS1的表達(dá)缺失有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織標(biāo)本中LZTS1的表達(dá)異常降低，且與患者肺癌組織的分化程度、TNM分期、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。這說明，肺癌的產(chǎn)生、惡性進(jìn)展均與患者機(jī)體內(nèi)LZTS1的表達(dá)受到抑制有關(guān)。張彥兵等[11]通過體外研究發(fā)現(xiàn)，在肝癌細(xì)胞中，miR-135b對(duì)肝癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移的促進(jìn)作用均是通過抑制LZTS1的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的，因此肝癌組織中miR-135b的表達(dá)與LZTS1的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)，肺癌組織標(biāo)本中miR-135b的表達(dá)與LZTS1的表達(dá)呈顯著的負(fù)相關(guān)。這說明，miR-135b、LZTS1可在肺癌的產(chǎn)生、惡性進(jìn)展的過程中起到相互拮抗的作用。

綜上所述，肺癌組織中miR-135b的表達(dá)明顯升高，其中LZTS1的表達(dá)則明顯降低，miR-135b可能通過下調(diào)LZTS1參與肺癌的發(fā)生與發(fā)展。