黃 元，劉 濤，陳錦良，王曉虎，陳 晶，梁培新，黃 武，向 華

（1.廣東省農(nóng)業(yè)科學院動物衛(wèi)生研究所/廣東省獸醫(yī)公共衛(wèi)生公共實驗室/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室/農(nóng)業(yè)部獸用藥物與診斷技術(shù)廣東科學觀測實驗站，廣東 廣州 510640；2.廣東源豐農(nóng)業(yè)有限公司，廣東 陽江 529938；3.廣東宏豐農(nóng)牧有限公司，廣東 英德 513036 ）

塞內(nèi)卡病毒病是由小核糖核酸病毒科塞內(nèi)卡病毒屬的塞內(nèi)卡病毒A（Seneca virus A,SVA）引起的一種主要感染豬的病毒性傳染病。病毒直徑約為25～30 nm，正二十面體結(jié)構(gòu)，分子結(jié)構(gòu)為單股正鏈非分段RNA［1］。該病毒可引起豬產(chǎn)生類似水皰樣病變，感染豬的鼻吻、蹄冠等部位［2］，臨床上出現(xiàn)鼻孔囊泡破裂和侵蝕，蹄冠狀動脈帶囊泡破裂后會導致豬只跛行［3］。美國、巴西等地的臨床研究表明，1周齡仔豬感染SVA后，臨床表現(xiàn)為肥胖、肌無力、食欲不振、嗜睡、唾液分泌過多、皮膚充血、腹瀉，并且有神經(jīng)系統(tǒng)表現(xiàn)，有些仔豬會突然死亡。臨床癥狀一般持續(xù)3～10 d，然后在存活的仔豬中消失。對仔豬進行常規(guī)剖檢，表現(xiàn)為腎臟淤點出血，舌頭出現(xiàn)潰瘍性損傷［4］。該病本身死亡率不高，但易造成繼發(fā)感染，可致仔豬死亡率高達30%～70%［5］。由于與口蹄疫等水皰性疾病難以區(qū)分，容易造成恐慌。

塞內(nèi)卡病毒最初引起人們的注意是在胎牛血清或胰酶污染的細胞培養(yǎng)液中［6］。2008年SVA在美國的豬群中發(fā)現(xiàn)，繼而席卷美國、加拿大、巴西、澳大利亞、新西蘭、泰國、哥倫比亞等國家［7］，在世界范圍內(nèi)引起廣泛關(guān)注。2015年我國廣東首次發(fā)現(xiàn)SVA，目前SVA已在我國多個省市暴發(fā)［8-10］。但我國對SVA的臨床報道仍然很少，對其發(fā)病豬群的抗體水平也未見檢測分析數(shù)據(jù)。

2017年4月，廣東省陽江地區(qū)某豬場發(fā)生疑似塞內(nèi)卡病毒感染癥狀。為進一步了解SVA為防控積累數(shù)據(jù)，本研究對該豬場采集的患病組織和血清進行病毒分離，建立了微量血清抗體中和試驗方法，并進行了抗原和抗體檢測分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的疑似SVA發(fā)病豬蹄部水泡皮和16份豬血清均來自廣東省陽江地區(qū)某豬場。

主要試劑：TakaRa ExTaq DNA聚合酶、pMD19-T質(zhì)粒和DH5α感受態(tài)細胞，購自寶生物工程（大連）有限公司；病毒RNA/DNA提取試劑盒、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒，購自美基生物科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 RT-PCR檢測 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃）， 取 上 清， 用病毒RNA/DNA提取試劑盒提取病毒總核酸進行RT-PCR檢測。引物按照文獻［11］合成，針對VP1-2A基因，上游引物序列為5’-TCGGTTTACTCCGCTGATGGTTGG-3’；下游引物序列為5’-AGGACCAGGATTGGTCTCGATATC-3’。RT-PCR反應(yīng)條件：42℃ 30 min；94℃ 5 min；94℃ 1 min、55℃ 1 min、72℃ 1.5 min，35 個循環(huán)；72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，觀察結(jié)果。

1.2.2 基因克隆和序列測定 PCR產(chǎn)物電泳后用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收980 bp左右的片段，連接至pMD19-T載體，用質(zhì)粒小量快速抽提試劑盒提取質(zhì)粒，由華大基因公司測序。對核苷酸序列進行BLAST在線分析，并用MEGA6軟件與GenBank上下載的參考毒株進行序列比對分析。

1.2.3 病毒分離及滴度測定 水泡皮研磨后離心10 min（12 000 r/min，4℃），上清液用0.22 μm濾器過濾后接種至PK-15細胞，培養(yǎng)5 d后若無病變產(chǎn)生則凍融3次再次接種細胞，產(chǎn)生病變后的培養(yǎng)產(chǎn)物在PK-15細胞上進行病毒傳代，培養(yǎng)產(chǎn)物10倍梯度稀釋后接種96孔板，測定對PK-15細胞的TCID50［7］，72 h后觀察病變，以K?rber法計算結(jié)果。

1.2.4 微量血清抗體中和試驗 按照文獻［12］的方法進行微量血清抗體中和試驗。將待測血清于56℃下水浴1 h，以除去血清中的補體及其他干擾物質(zhì)。處理后的待測血清用含2%胎牛血清的MEM培養(yǎng)液進行2倍梯度稀釋，然后在96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加50 μL；病毒液稀釋至100 TCID50/50μL，每孔加入50 μL，于37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中放置1 h后加入PK-15細胞懸液，同時設(shè)立病毒回歸對照；置37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 RT-PCR結(jié)果

從病料提取核酸進行RT-PCR，對PCR產(chǎn)物進行電泳，結(jié)果觀察到接近1 000 bp的單一條帶（圖1）。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體，其測序結(jié)果表明，獲得長度為980 bp的VP1-2A序列。

圖1 SVA VP1-2A的RT-PCR擴增產(chǎn)物電泳結(jié)果

2.2 VP1-2A核苷酸序列分析

對本研究獲得的毒株命名為CHGDYJ-2017，將所克隆的VP1-2A基因序列與GenBank上的SVA同區(qū)段序列進行比對分析，建立系統(tǒng)進化樹（圖2）。與 CH-GDYJ-2017同源性最高的是2015年美國毒株USA/GBI29/2015（KT827251），同源性為99.2%；同源性最遠的是2008年美國毒株SVV-001（DQ641257），同源性為91.3%，表明結(jié)構(gòu)蛋白基因VP1附近仍舊是變異較快的區(qū)域，但并未顯現(xiàn)明顯的時間或地域相關(guān)的變異特征。

在我國流行毒株中，與本研究獲得的毒株CH-GDYJ-2017關(guān)系最近的是CH-HN-2017（97.1%），最遠的是CH-01-2015（92.2%），表明我國的SVA病毒已經(jīng)在多地流行并且呈現(xiàn)一定的變異趨勢。

圖2 SVA VP1-2A核苷酸序列系統(tǒng)進化樹

2.3 病毒分離及滴度測定結(jié)果

將水泡皮處理產(chǎn)物接種PK-15細胞后，盲傳4代后產(chǎn)生明顯細胞病變。在PK-15細胞上傳代4次后測定病毒滴度，滴度可達107TCID50/0.1mL。

2.4 抗體中和試驗結(jié)果

從采集的16份血清樣本數(shù)據(jù)來看，無論豬只發(fā)病與否，均有中和抗體出現(xiàn)（表1），說明均有過感染。9頭種豬全部感染SVA，其中6頭發(fā)病，發(fā)病率為66.7%。按抗體效價大于等于1∶64為陽性計算［13］，受檢的16份樣品中有11份陽性，總感染率為68.8% 。6頭發(fā)病種豬的中和抗體效價非常高，3頭臨床未發(fā)病的種豬的抗體效價也都達到了1∶1 024以上，最高達1∶4 096。

表1 抗體中和試驗結(jié)果

3 結(jié)論與討論

塞內(nèi)卡病毒（SVA）作為一種新的外來病原，已經(jīng)在我國部分地區(qū)流行，未來幾年可能會繼續(xù)呈現(xiàn)蔓延的趨勢，由于當前市場尚無SVA疫苗出售，隨著傳播范圍的擴大，必將造成更大的經(jīng)濟損失［14］。雖然其危害沒有口蹄疫那樣嚴重，但是由于其臨床癥狀與口蹄疫極其類似，因此，為了鑒別和區(qū)分，避免不必要的恐慌，做好疫病的預防和監(jiān)控迫在眉睫。相關(guān)部門應(yīng)及時關(guān)注國內(nèi)外疫情相關(guān)動態(tài)，掌握塞內(nèi)卡病毒的流行趨勢及其帶來的環(huán)境風險，確保第一時間對SVA進行合理的應(yīng)對和處置。

本次抽檢的16份血清樣本全部來自廣東陽江某豬場。從中和試驗的結(jié)果來看，抗體陽性率為68.8%（≥1∶64）。其中種豬抗體陽性率為100%，抗體效價均達到1∶1 024以上，未發(fā)病豬抗體陽性率為50%。說明SVA的免疫原性很強，能夠刺激動物機體產(chǎn)生很高的抗體水平。發(fā)病豬中和抗體效價非常高，與FMD臨床發(fā)病相比，SVA臨床發(fā)病豬康復快，與臨床實際相一致。這次豬場發(fā)病均為種豬，未見哺乳仔豬、保育豬、肥豬發(fā)病。這與國外文獻報道的仔豬死亡率高不一致［4-5］。因此我們檢測了除母豬以外的其他階段豬的中和效價，發(fā)現(xiàn)多個階段豬均有感染，只是未見臨床表現(xiàn)，后續(xù)將進一步加強臨床觀察和深入研究其具體原因。

本研究從廣東陽江地區(qū)某豬場的疑似病料中檢出SVA并進行分離，建立了微量血清抗體中和試驗方法，為SVA的流行病學研究提供了工具［15］。對同為小核糖核酸病毒科的口蹄疫病毒（FMDV）的研究表明，F(xiàn)MDV的抗原具有高度變異性［16-17］，病毒核衣殼的變異順序為VP1＞VP2＞VP3＞VP4，由于VP1基因的核苷酸易發(fā)生變異，因此，在分子流行病學調(diào)查中可通過比較分析VP1基因的核苷酸序列之間的差異來分析各毒株之間的變異情況，為研究不同毒株的親緣關(guān)系奠定基礎(chǔ)［17］。SVA與FMDV同屬小核糖核酸病毒科，在核苷酸序列分析上可以采用同樣的方法［18］。對VP1基因測序比對的結(jié)果表明，分離株與美國2015年毒株USA/GBI29/2015同源性較高（99.2%），而與我國毒株同源性最高僅為97.1%（2017年毒株CH-HN-2017）。從系統(tǒng)進化樹來看，目前我國流行毒株已經(jīng)產(chǎn)生多個分支。這表明SVA可能先后多次傳入我國［19］。此外，廣東株（CH-01-2015）和湖北株（HB-CH-2016）序列比對同源性為100%，說明這兩個地區(qū)之間毒株傳播迅速，短期內(nèi)就已經(jīng)跨越多個省份，需要更加密切關(guān)注SVA在我國其他省份的流行情況［20］。我國對外來疫病的防控制度和應(yīng)對措施還需要進一步完善［15］。本研究選取不同國家和我國不同地區(qū)不同時間段具有代表性的毒株，對部分序列遺傳關(guān)系進行分析，如需獲得更加準確的遺傳進化關(guān)系，可對各流行毒株的全基因組序列進行全面系統(tǒng)的分析。