張亞飛 余輝 鄭百俊 謝崇 葛鑫 李鵬 高亞 潘偉康

先天性巨結(jié)腸癥（hirschsprung disease，HSCR）是由神經(jīng)嵴細胞發(fā)育受損導(dǎo)致的常見消化疾病，腸神經(jīng)節(jié)細胞缺乏為其主要特征[1]。HSCR是由多種因素引起的復(fù)雜疾病，包括調(diào)節(jié)胚胎期的腸神經(jīng)嵴細胞增殖分化的遺傳和環(huán)境因子[2]。這種發(fā)育障礙表現(xiàn)為新生兒和兒童的功能性腸梗阻。 HSCR的發(fā)病率約為1/5 000，新生兒的男性和女性的比例為4 : 1[3-4]。目前尚無理想的根治手段，因此深入研究HSCR的發(fā)病機制為提高HSCR的療效具有重要意義。

miRNA為19 ～ 25個核苷酸大小的內(nèi)源性小非編碼RNA，在多種細胞過程中起重要作用，如細胞增殖、分化和遷移[5-6]。miRNA的失調(diào)已被證實與HSCR相關(guān)，如miR-939、miR-181通過抑制細胞增殖參與HSCR的發(fā)生發(fā)展[7]。國內(nèi)外大量研究表明，miR-34a-5p與腫瘤的增殖和遷移密切相關(guān)，但其在HSCR病理過程中的作用未見報道[8]。本研究探討miR-34a-5p對HSCR中神經(jīng)嵴細胞增殖的影響及其作用機制。

材料與方法

一、材料

（一）實驗材料

人神經(jīng)嵴細胞SH-SY5Y（購于美國菌種保藏中心-ATCC）。選擇2015年8月至2017年2月在陜西省核工業(yè)二一五醫(yī)院經(jīng)病理確診并實施手術(shù)切除的HSCR患者結(jié)腸組織10例，從未患HSCR或其他先天性異常的患者中取正常結(jié)腸組織10例，每例標(biāo)本均經(jīng)過病理科醫(yī)師嚴格鑒定。所有組織樣本取下后迅速置于液氮凍存。本實驗方案通過倫理委員會審批，并取得患者知情同意。

（二）試劑

胎牛血清（美國HyClone公司），DMEM細胞培養(yǎng)基 （美國Gibico公司），胰酶、Lipofectamine 2000（美 國 Thermo fisher公 司），miR- 34a-5p mimics及其對照物miR-NC （廣州銳博生物科技有限公司），CCK8 （美國Sigma公司），GMFB Rabbit mAb （美國Santa公司），GAPDH Rabbit mAb （美國CST公司）。

二、實驗方法

（一）細胞培養(yǎng)與細胞轉(zhuǎn)染

人神經(jīng)嵴細胞系SH-SY5Y用含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)，每2天換1次培養(yǎng)基，細胞匯合至80%以上傳代培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前1 d，6孔板接種SH-SY5Y細胞，用不含抗生素的培養(yǎng)基培養(yǎng)。待細胞密度達到70% ～80%的時候，按照Lipofectamine 2000操作說明進行細胞轉(zhuǎn)染，6 h后去除6孔板內(nèi)培養(yǎng)基，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。37 ℃、5% CO2正常培養(yǎng)后用于后續(xù)檢測實驗。

（二）CCK8法檢測細胞死亡率

取轉(zhuǎn)染后的SH-SY5Y細胞，0.25%胰酶消化離心，接種5×103個細胞于96孔板中，37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每組設(shè)置6個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h，每孔加入10 μl CCK8培養(yǎng)液，于細胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h后，于酶標(biāo)儀450 nm下測定吸光值（A450），并繪制CCK8曲線圖。

（三）雙熒光素酶報告基因分析

通過生物信息學(xué)在線預(yù)測出miR-34a-5p與GMFB的3'UTR之間存在堿基互補關(guān)系。通過點突變構(gòu)建GMFB 3'UTR突變型載體（3'UTR MUT），分別將miR-34a-5p mimics及其對照物miR-NC與GMFB 3'UTR野生型（WT）和突變型載體（MUT）轉(zhuǎn)染進SH-SY5Y。48 h后收集細胞，按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒操作說明，檢測細胞中螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶活性。

（四）熒光定量PCR檢測miR-34a-5p的表達

取液氮凍存的結(jié)腸組織樣本，將組織于液氮中充分研磨，加入適量的Trizol試劑，提取結(jié)腸組織的總RNA，然后按照miRNA cDNA合成試劑盒說明書將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照miRNA熒光定量PCR試劑盒說明書進行PCR體系的配制。以U6為內(nèi)參，檢測miR-34a-5p的相對表達量。

（五）Western Blot檢測蛋白表達

培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的人神經(jīng)嵴細胞SH-SY5Y，處理后加入蛋白裂解液收集細胞蛋白樣品，定量后取等量蛋白樣品進行 SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入（1 : 500）稀釋的抗GMFB抗體（GAPDH為內(nèi)參），室溫孵育1 h。洗滌后加入HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育1 h，洗滌后加入化學(xué)發(fā)光液顯色，成像拍照，軟件進行灰度值統(tǒng)計分析。

三、統(tǒng)計學(xué)分析方法

實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件進行分析，結(jié)果重復(fù)3次，CCK8、雙熒光素酶報告基因檢測、熒光定量PCR和Western Blot實驗數(shù)據(jù)采用± s表示。兩組間的比較采用t檢驗，多組間的比較采用單因素方差分析，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、miR-34a-5p在HSCR組織中表達下調(diào)

熒光定量PCR結(jié)果表明，HSCR結(jié)腸組中的miR-34a-5p的相對表達量為0.43±0.10，與正常結(jié)腸組1.15±0.18相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01），提示miR-34a-5p可能在 HSCR 的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用（圖1）。

圖1 miR-34a-5p在HSCR和正常結(jié)腸組織中的表達量

二、miR-34a-5p抑制神經(jīng)嵴細胞SH-SY5Y細胞活力

CCK8結(jié)果所示，miR-34a-5p mimics組細胞在培養(yǎng)24 h和48 h后細胞A450值分別為0.53±0.03和0.87±0.04，分別與miR-NC對照組（0.87±0.03，1.42±0.04）比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，表1）。這表明miR-34a-5p能抑制神經(jīng)細胞增殖能力。

三、GMFB是miR-34a-5p的靶基因

生物信息學(xué)在線預(yù)測出miR-34a-5p與GMFB的3'UTR之間存在堿基互補關(guān)系。雙熒光素酶報告基因檢測結(jié)果顯示，miR-34a-5p mimics與GMFB 3'UTR WT載體共轉(zhuǎn)染組熒光強度為0.44±0.03，明顯低于對照miR-NC與WT載體共轉(zhuǎn)染組1.02±0.06，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01）。而miR-34a-5p mimics與GMFB 3'UTR MUT載體共轉(zhuǎn)染組與其對照miR-NC與MUT載體共轉(zhuǎn)染組之間的熒光強度無差異（P＞ 0.05，圖 2，表 2～3）。這表明GMFB是miR-34a-5p下游靶基因之一。

四、GMFB促進神經(jīng)嵴細胞增殖

CCK8結(jié)果所示，miR-34a-5p mimics+GMFB組細胞培養(yǎng)24 h和48 h后，A450值分別為0.99 ±0.02和 1.50 ± 0.03，分別與 miR-34a-5p mimics組（0.53±0.03，0.87±0.04）比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，表4）。GMFB能促進神經(jīng)細胞增殖能力，這揭示miR-34a-5p對細胞活力的影響與GMFB的表達有關(guān)。

表1 miR-34a-5p mimics組和miR-NC組細胞在不同時間細胞活力（A450）的比較結(jié)果（± s）

表1 miR-34a-5p mimics組和miR-NC組細胞在不同時間細胞活力（A450）的比較結(jié)果（± s）

注：與miR-NC組比較，aP ＜ 0.01

分組 樣本數(shù) 12 h 24 h 48 h miR-NC組 3 0.47±0.03 0.87±0.03 1.42±0.04 miR-34a-5p mimics組 3 0.46±0.03 0.53±0.03a 0.87±0.04a t 值 0.45 7.07 9.14 P值 0.68 ＜ 0.01 ＜ 0.01

表2 qRT-PCR引物序列

五、miR-34a-5p對神經(jīng)嵴細胞GMFB蛋白表達的影響

Western Blot檢測結(jié)果顯示，miR-34a-5p mimics組細胞的GMFB蛋白表達量為0.25±0.01，與miR-NC對照組0.90±0.03比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意 義（P＜ 0.01）。miR-34a-5p mimics+GMFB 組 細胞GMFB蛋白表達量為1.03±0.03，與miR-34a-5p mimics組（0.25±0.01）比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜ 0.01，圖3）。這表明miR-34a-5p可以調(diào)控SHSY5Y細胞GMFB蛋白的表達水平，可能通過調(diào)控GMFB蛋白的表達水平影響細胞增殖能力。

圖3 miR-34a-5p對人神經(jīng)嵴細胞GMFB蛋白表達的影響

討 論

HSCR是以新生兒和兒童的功能性腸梗阻為表現(xiàn)形式的常見消化疾病[9]。HSCR的病因未知，學(xué)者普遍認為是胚胎期腸神經(jīng)嵴細胞分化和發(fā)育受損，最終導(dǎo)致腸神經(jīng)節(jié)細胞的缺乏[10～11]。腸神經(jīng)嵴細胞在胚胎發(fā)生過程中經(jīng)歷了長達數(shù)周的遠端腸道途徑，影響腸神經(jīng)細胞增殖、存活、遷移或分化的因素都可能導(dǎo)致神經(jīng)節(jié)細胞增生，最終導(dǎo)致HSCR。在HSCR的研究中，由于HSCR的腸神經(jīng)嵴細胞模型的限制，筆者搜索了許多論文并發(fā)現(xiàn)了一種合適的細胞系，即SH-SY5Y細胞。大量研究表明，抑制SH-SY5Y的遷移和增殖能夠抑制HSCR的發(fā)生發(fā)展[12]。因此本研究中，神經(jīng)嵴細胞SH-SY5Y細胞系被用于HSCR患者腸神經(jīng)細胞的細胞模型。研究影響神經(jīng)嵴細胞增殖和凋亡的調(diào)控因子對于HSCR的治療具有重要的意義。

表3 miR-34a-5p mimics組和miR-NC組細胞的熒光素酶活性（FIR/REN）的比較結(jié)果（± s）

表3 miR-34a-5p mimics組和miR-NC組細胞的熒光素酶活性（FIR/REN）的比較結(jié)果（± s）

注：與miR-NC組比較，aP ＜0.01

分組 樣本數(shù) GMFB 3'UTR WT GMFB 3'UTR MUT miR-NC 組 3 1.02±0.06 1.04±0.03 miR-34a-5p mimics組 3 0.44±0.03a 1.08±0.02 t 值 8.56 1.10 P值 ＜ 0.01 0.33

表4 兩組細胞在不同時間細胞活力（A450）的比較結(jié)果（± s）

表4 兩組細胞在不同時間細胞活力（A450）的比較結(jié)果（± s）

注：與 miR-34a-5p mimics組比較，aP ＜0.01

分組 樣本數(shù) 12h 24h 48h miR-34a-5p mimics組 3 0.46±0.03 0.53±0.03 0.87±0.04 miR-34a-5p mimics+GMFB 組 3 0.47±0.02 0.99±0.02a 1.50±0.03a t 值 0.28 11.03 12.68 P值 0.79 ＜ 0.01 ＜ 0.01

miRNA具有調(diào)控癌基因和抑癌基因的作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等各種疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要的作用[13～14]。miR-34a-5p是廣泛存在哺乳動物中的一類高度保守的miRNA，國內(nèi)外大量研究表明miR-34a-5p具有抑癌作用，對胃癌和結(jié)腸癌等癌癥具有抑制作用[15～16]。本研究推測miR- 34a-5p對HSCR也具有影響，基于該推論，通過Q-PCR檢測了miR-34a-5p在HSCR組織中的表達水平，結(jié)果表明miR-34a-5p在HSCR組織中表達下調(diào)，通過雙熒光素酶報告基因檢測了miR-34a-5p的靶基因，并通過CCK8實驗檢測了miR-34a-5p及其靶基因?qū)ι窠?jīng)嵴細胞增殖的影響，結(jié)果顯示miR-34a-5p能夠抑制神經(jīng)嵴細胞增殖，這與國內(nèi)外其他的研究結(jié)果一致，即miR-34a-5p作為抑癌調(diào)控因子抑制細胞的增殖和遷移。

神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子（glia maturation factor，GMF）作為一種生長和分化因子于1972年首次在牛腦中分離出來[17]。該蛋白質(zhì)實際上是兩種化合物的混合物：神經(jīng)膠質(zhì)成熟因子-β （GMFB）和GMF-γ。GMFB是一種高度進化的保守蛋白質(zhì)，主要在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，而其表達也在包括結(jié)腸、胸腺和腎臟的各種其他組織中檢測到[18]。有研究表明，GMFB是創(chuàng)傷性腦損傷后反應(yīng)性膠質(zhì)增生所必需的[19]。而且有研究表明，GMFB能夠促進免疫T細胞和神經(jīng)細胞增殖和分化[19～20]。本研究通過雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炞C實了miR-34a-5p能夠與GMFB 3'UTR結(jié)合，影響GMFB的啟動子活性，而免疫印跡結(jié)果也證實了miR-34a-5p mimics能夠抑制GMFB的蛋白表達，進一步證實了GMFB是miR-34a-5p的下游靶基因。CCK8檢測顯示，GMFB過表達能夠抑制miR-34a-5p mimics誘導(dǎo)的細胞活力的降低，證實了miR-34a-5p對神經(jīng)嵴細胞增殖調(diào)控是通過影響靶基因GMFB的蛋白表達水平來實現(xiàn)的。國內(nèi)外研究表明，GMFB與人膠質(zhì)瘤新生血管形成和預(yù)后不良有關(guān)，抑制GMFB能夠抑制膠質(zhì)瘤細胞的增殖[21]。本研究結(jié)果與國內(nèi)外的其他研究結(jié)果一致，即抑制GMFB的蛋白的表達能夠抑制細胞的增殖和分化。

綜上所述，本研究證實了GMFB是miR-34a-5p下游重要靶基因之一，miR-34a-5p能抑制人神經(jīng)嵴細胞增殖，并且抑制GMFB蛋白表達。miR-34a-5p調(diào)控神經(jīng)嵴細胞增殖可能與其靶向抑制GMFB的表達有關(guān)，其作用機制還需要進一步研究。本研究結(jié)果有助于了解miR-34a-5p和GMFB在HSCR中的作用，為HSCR的治療提供理論依據(jù)和實驗基礎(chǔ)。