張晉 袁哲

與骨髓來(lái)源干細(xì)胞相比，臍帶血造血干細(xì)胞具有獲取快速、來(lái)源廣泛、供者風(fēng)險(xiǎn)低、移植物抗宿主病發(fā)生率低等優(yōu)點(diǎn)，臍帶血移植已被廣泛用于治療多種血液系統(tǒng)疾病[1]。然而，由于細(xì)胞總數(shù)有限，臍帶血造血干細(xì)胞移植并不適合用于年齡較大的患者。在臨床應(yīng)用中，有核細(xì)胞總數(shù)（total nucleated cells，TNC）是臍帶血供體選擇的主要依據(jù)，而臍帶血采集量和每單位體積的白細(xì)胞計(jì)數(shù)是決定TNC大小的關(guān)鍵指標(biāo)。本研究回顧分析了389例臍帶血樣本的TNC和采集量以及影響二者的母嬰因素和采集處理因素，旨在優(yōu)化臍帶血的采集和實(shí)驗(yàn)室處理流程，從而提高臍帶血的保存質(zhì)量。

材料與方法

一、材料

1.臍帶血采血袋：一次性使用塑料血袋（規(guī)格型號(hào)為200 ml，山東威高公司），血液保存液（含量為28 ml，成份為枸櫞酸、枸櫞酸鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖及腺嘌呤，批號(hào)為14101821，生產(chǎn)日期為20141018，有效期為201609，經(jīng)高壓蒸汽滅菌、無(wú)菌、無(wú)熱源、一次性使用）。本研究為回顧性分析，所有數(shù)據(jù)均來(lái)自計(jì)算機(jī)系統(tǒng)。不論是自體保存還是公共捐獻(xiàn)， 389 份臍帶血在采集之前均獲得產(chǎn)婦/家屬的知情同意并簽訂了保存/捐獻(xiàn)協(xié)議。

2.臍帶血采集對(duì)象：采集之前必須獲得產(chǎn)婦/ 家屬的知情同意，詳細(xì)詢(xún)問(wèn)產(chǎn)婦的病史、妊娠史、傳染病史和遺傳病史并檢查各項(xiàng)檢驗(yàn)結(jié)果；產(chǎn)婦年齡不小于18歲，孕齡不少于36周，無(wú)傳染性疾病，無(wú)惡性腫瘤及遺傳性疾病，無(wú)血液系統(tǒng)疾病及免疫系統(tǒng)疾病，妊娠期間無(wú)嚴(yán)重合并癥等；胎兒體重大于2 500 g，無(wú)畸形，無(wú)窒息、水腫、黃疸、感染；凡不符合以上要求者均應(yīng)排除在采集對(duì)象之外[2]。

3. 389份臍帶血的平均采集量為75 ml（30 ～170 ml）；TNC 數(shù)平均為 6.6，TNC 最小者為 2.1，最大者達(dá)28.3。母嬰因素中，母親平均年齡32歲；平均孕齡39周；新生兒平均體重3 399 g，最大為4 700 g，最小為2 500g；剖宮產(chǎn)為主要分娩方式，占69.9%；新生兒中男性偏多，占52.4%；產(chǎn)婦中多數(shù)為第1胎，占50.4%，少數(shù)為第2胎和第3胎。采集處理因素中，采集至計(jì)數(shù)間隔最短為1 h，最長(zhǎng)為45 h；采集方式有第三產(chǎn)程采集、體外采集以及兩種方式混合采集，但以第三產(chǎn)程采集為主，占76.1%。

二、實(shí)驗(yàn)方法

1.臍帶血采集：參照《臍帶血造血干細(xì)胞庫(kù)技術(shù)規(guī)范》和紐約臍帶血庫(kù)Rubinstein等[3]的分離方法，胎兒娩出后，在近胎盤(pán)端對(duì)臍帶穿刺部位進(jìn)行嚴(yán)格消毒，將采血針于止血鉗固定部位上端5 cm處快速刺入臍靜脈，使臍帶血通過(guò)重力作用流入一次性采血袋內(nèi)，同時(shí)輕輕搖晃采血袋，使臍帶血和保存液充分混勻，直至采集結(jié)束。采集后放于4 ℃冰箱保存并在48 h內(nèi)完成細(xì)胞計(jì)數(shù)和分離冷凍。

2.臍帶血處理及冷凍：參照紐約臍帶血庫(kù)Rubinstein等[3]的分離方法并結(jié)合實(shí)際經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)白細(xì)胞、紅細(xì)胞和血漿密度不同的特性，將6%羥乙基淀粉生理鹽水溶液與臍血以1 : 5比例加入臍帶血血袋中，通過(guò)四步離心將富含有核細(xì)胞的白膜層分離提取，并于15 min內(nèi)將冷凍保護(hù)劑[細(xì)胞內(nèi)保護(hù)劑采用二甲基亞砜（DMSO），細(xì)胞外保護(hù)劑采用低分子右旋糖酐，二者等體積混合，使DMSO終濃度為10%]加入裝有白膜層的冷凍袋中，程序降溫后置于-196 ℃液氮中保存。

3. TNC檢測(cè)：輕輕搖晃使臍帶血充分混勻，無(wú)菌技術(shù)抽取0.5 ml，使用KX-21型全自動(dòng)血液分析儀（日本SYSMEX）進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。檢測(cè)用稀釋液、溶血?jiǎng)┖颓鍧嵰壕鶠镾YSMEX配套試劑；各項(xiàng)操作均遵守實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；每次開(kāi)機(jī)后測(cè)定配套質(zhì)控品，結(jié)果合格后方可進(jìn)行常規(guī)檢測(cè)；定期參加衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心組織的室間質(zhì)量評(píng)價(jià)并全部通過(guò)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用 SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。臍帶血采集量與新生兒體重的相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)，而與母親年齡、孕齡、采集至計(jì)數(shù)間隔、TNC的相關(guān)性分析采用Spearman秩相關(guān)；TNC與母親年齡、孕齡、新生兒體重、采集至計(jì)數(shù)間隔和TNC的相關(guān)性分析均采用Spearman秩相關(guān)。孕齡、分娩方式兩組間采集量比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，新生兒性別兩組間采集量比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，新生兒體重、胎次、采集方式多組間采集量比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)；臍帶血采集量、孕齡、分娩方式、新生兒性別兩組間TNC比較采用Mann-WhitneyU檢驗(yàn)，新生兒體重、胎次、采集方式多組間TNC比較采用Kruskal-WallisH檢驗(yàn)。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、相關(guān)性分析

臍帶血采集量與TNC顯著相關(guān)（r= 0.723，P＜ 0.001）；母親年齡與采集量及TNC均無(wú)顯著相關(guān)；孕齡與采集量負(fù)相關(guān)（r= -0.119，P= 0.019），而與TNC正相關(guān)（r= 0.138，P= 0.007）；嬰兒出生體重與采集量及TNC均顯著正相關(guān)（r= 0.236,P＜0.001；r= 0.275，P＜ 0.001）；臍帶血采集至計(jì)數(shù)的時(shí)間間隔與采集量及TNC均無(wú)顯著相關(guān)（表1）。

表1 臍帶血采集量及TNC與母嬰及采集處理因素相關(guān)性分析

二、分組比較

TNC隨著臍帶血采集量的增加而增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001）；按是否足月，將孕齡分為＜ 37周和≥37周，隨著孕齡的延長(zhǎng)，TNC增加（P= 0.038）而臍帶血采集量并無(wú)變化；在嬰兒出生體重方面，臍帶血的采集量和TNC均隨出生體重的增加而增加（P＜ 0.001）；剖宮產(chǎn)的臍帶血采集量雖高于陰道分娩（P＜ 0.001），但其 TNC 不及陰道分娩；在嬰兒性別方面，男嬰與女?huà)朐谀殠а杉亢蚑NC之間無(wú)差異；產(chǎn)婦胎次數(shù)與臍帶血采集量和TNC之間無(wú)相關(guān)性；采用單一方式采集的臍帶血，在采集量和TNC之間無(wú)差異，但均高于采用混合方式采集的臍帶血（表2）。

表2 母嬰及采集處理因素對(duì)臍帶血采集量及TNC的影響

討 論

臍帶血造血干細(xì)胞移植有著廣闊的臨床應(yīng)用前景，臨床中評(píng)價(jià)移植用臍帶血質(zhì)量的常用指標(biāo)為T(mén)NC以及由此計(jì)算的CD34+細(xì)胞總數(shù)和集落總數(shù)，而TNC的大小主要取決于臍帶血采集量和每單位體積白細(xì)胞計(jì)數(shù)值。本研究對(duì)評(píng)價(jià)臍帶血保存質(zhì)量的采集量和TNC進(jìn)行了影響因素的相關(guān)性分析和分組探討，其中母嬰因素包括母親年齡、孕齡、新生兒出生體重、分娩方式、新生兒性別以及懷孕胎次，采集處理因素包括臍帶血采集至計(jì)數(shù)的時(shí)間間隔以及臍帶血的采集方式。

臍帶血采集量通常被作為臍帶血處理前是否廢棄的直接標(biāo)準(zhǔn)，2011年對(duì)5910份臍帶血廢棄原因的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，高達(dá)30%的臍帶血因采集量不足被廢棄[4]。有研究顯示，臍帶血采集量與反映臍帶血重建造血潛能的TNC、CD34+細(xì)胞總數(shù)和集落總數(shù)均具有明顯相關(guān)性，采血量越多，TNC值越高，能夠滿(mǎn)足的高體重患者數(shù)越多，庫(kù)存臍帶血的利用率就越高[5]。本研究中臍帶血采集量與TNC呈顯著正相關(guān)，隨著采集量的增加，TNC數(shù)呈穩(wěn)定上升，說(shuō)明采集技術(shù)是影響臍帶血質(zhì)量的關(guān)鍵因素。為提高庫(kù)存臍帶血的TNC，以適合更多更大體重的患者使用，實(shí)際工作中應(yīng)優(yōu)化臍帶血的采集方法（第三產(chǎn)程或體外采集）或通過(guò)設(shè)定更加合理的采集對(duì)象標(biāo)準(zhǔn)（出生體重較大嬰兒），從而提高臍帶血的采集量，這與羅曉菊等[6]研究結(jié)果相同。

在母嬰因素中，孕齡與TNC呈正相關(guān)，TNC隨孕齡的延長(zhǎng)而增加，這可能與胎兒體重隨孕齡增加有關(guān)，這一結(jié)果與Robert等[7]結(jié)果基本一致。嬰兒出生體重與臍帶血采集量和TNC均呈明顯正相關(guān)，將體重按照每增加500 g分為4組，隨著體重的增加，臍帶血采集量和TNC均呈穩(wěn)定上升趨勢(shì)，說(shuō)明嬰兒出生體重是影響臍帶血質(zhì)量的關(guān)鍵因素，這與吳潔瑩等[8]報(bào)道的嬰兒體重是預(yù)測(cè)臍帶血造血潛能重要指標(biāo)的結(jié)果一致。以往研究認(rèn)為，陰道分娩可能通過(guò)應(yīng)激反應(yīng)、壓力作用等刺激細(xì)胞因子分泌增加從而導(dǎo)致臍帶血中含有較高數(shù)量的原始細(xì)胞[9]，本研究中經(jīng)陰道分娩的臍帶血TNC雖高于剖宮產(chǎn)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這可能與分娩方式的構(gòu)成比例不同有關(guān)。近年來(lái)我國(guó)的剖宮產(chǎn)數(shù)量逐年增加（本研究中高達(dá)70%），其中相當(dāng)一部分產(chǎn)婦未達(dá)到自然孕齡或缺乏醫(yī)學(xué)指征，這些因素都可能導(dǎo)致有核細(xì)胞計(jì)數(shù)低于正常狀態(tài)的陰道分娩。今后研究若擴(kuò)大標(biāo)本數(shù)量，其結(jié)果對(duì)評(píng)價(jià)分娩方式尤其是陰道分娩對(duì)臍帶血TNC含量影響的意義會(huì)更大。與男嬰相比，女?huà)氲哪殠а猅NC數(shù)量略有增加，這與吳潔瑩等[8]報(bào)道一致，但二者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)。

在采集處理因素中，第三產(chǎn)程采集法即體內(nèi)采集法，即待胎兒娩出后，立即用止血鉗夾住臍帶，使用碘酒消毒后進(jìn)行臍靜脈穿刺，一般可在胎兒娩出10 s內(nèi)獲得臍帶血，而體外采集法為待胎盤(pán)剝離后再進(jìn)行臍帶消毒和臍帶血采集[10]。與體外采集法相比，第三產(chǎn)程采集因采集及時(shí)可獲得較多血量，但本研究并未發(fā)現(xiàn)兩者在采集量上存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，可能和本研究納入的標(biāo)本數(shù)量較少有關(guān)，但采用單一方式獲得的臍帶血量和TNC均高于采用混合方式采集的臍帶血。

綜上所述，該研究通過(guò)分析母嬰因素及采集處理因素對(duì)臍帶血采集量和TNC的影響，為臨床合理選擇采集對(duì)象以及實(shí)驗(yàn)室有效改進(jìn)操作方法提供了重要的參考依據(jù)。研究結(jié)果提示為了提高臍帶血產(chǎn)品的保存質(zhì)量，減少不必要的資源浪費(fèi)，應(yīng)側(cè)重選擇孕齡較長(zhǎng)、胎兒體重較大、經(jīng)陰道分娩的產(chǎn)婦作為臍帶血的提供者，同時(shí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)首先處理采集量較大的臍帶血。