王鐵良,魏亮亮,劉冰杰,郭 潔,賀 平，周曉華,魏 紅,汪 紅

(1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，鄭州 450002； 2.農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估實(shí)驗(yàn)室(鄭州)，鄭州 450002； 3.河南省糧食質(zhì)量安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002)

蛋白質(zhì)是大豆重要的組成成分之一，大豆蛋白所含的必需氨基酸較為豐富，是植物性的完全蛋白，因其基因結(jié)構(gòu)最接近人體氨基酸，所以是最具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的植物蛋白，同時(shí)也是大豆重要的營(yíng)養(yǎng)評(píng)價(jià)指標(biāo)之一。水溶性蛋白是大豆蛋白的重要組成部分，約占大豆總蛋白含量的70%，主要由7S組分和11S組分組成[1]。大豆水溶性蛋白極易被人體吸收，具有良好的功能性質(zhì)如凝膠性、乳化性、發(fā)泡性等，在大豆的加工利用中有著重要作用[2]。大豆水溶性蛋白含量(SPC)是評(píng)價(jià)大豆品質(zhì)及衡量其價(jià)值的重要指標(biāo)[3-5]，同時(shí)也是大豆是否適宜儲(chǔ)存的重要判定指標(biāo)[6-8]。因此，開(kāi)展大豆水溶性蛋白的快速、準(zhǔn)確分析方法研究具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

目前，大豆水溶性蛋白的測(cè)定方法主要有凱氏定氮法[9-11]、考馬斯亮藍(lán)法[12-13]及偶氮胭脂紅G比色法[14-15]。凱氏定氮法是大豆水溶性蛋白檢測(cè)現(xiàn)行有效的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法[10-11]，也是目前研究機(jī)構(gòu)和檢驗(yàn)檢測(cè)機(jī)構(gòu)測(cè)定大豆水溶性蛋白的主要分析方法。然而，該方法試驗(yàn)過(guò)程煩瑣，對(duì)操作人員要求較高，且試樣消解過(guò)程會(huì)產(chǎn)生酸氣、強(qiáng)堿溶液等對(duì)人體和環(huán)境有毒有害的“三廢”物質(zhì)，不太適合大批量試樣的分析檢驗(yàn)?？捡R斯亮藍(lán)法和偶氮胭脂紅G比色法試驗(yàn)消耗小、成本低，且靈敏度較高，適用于蛋白質(zhì)含量較低的樣品。然而，大豆水溶性蛋白含量較高，考馬斯亮藍(lán)法和偶氮胭脂紅G比色法線性范圍較窄，減小稱(chēng)樣量或增加稀釋倍數(shù)均會(huì)引入更大的不確定度，影響分析結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，不適合大批次大豆試樣的水溶性蛋白分析工作。

本研究建立了一種杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定大豆水溶性蛋白的分析方法，通過(guò)優(yōu)化大豆水溶性蛋白的提取方法和杜馬斯燃燒定氮儀的儀器試驗(yàn)條件，快速、準(zhǔn)確、無(wú)污染測(cè)定大豆中水溶性蛋白含量，以期為大豆水溶性蛋白的分析檢驗(yàn)提供一種新的可行方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 原料與試劑

大豆-1、大豆-2、大豆-3、大豆-4、大豆-5(均由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物科學(xué)研究所提供)。

實(shí)驗(yàn)用超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)，鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(GBW081127,c=0.100 0 mol/L)，氫氧化鈉(優(yōu)級(jí)純)，混合催化劑(瑞典FOSS)，濃硫酸(優(yōu)級(jí)純)，甲基紅指示劑(分析純)，溴甲酚綠指示劑(分析純)，氮?dú)狻⒀鯕?、氦?≥99.999%，北京普萊克斯)。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DT-Dumatherm杜馬斯燃燒定氮儀(德國(guó)Gerhard);2300全自動(dòng)凱氏定氮儀(丹麥FOSS)；2040消化爐(丹麥FOSS)；Mettler-Toledo萬(wàn)分之一電子天平;EH20B電熱板；JK-APG-50高速粉碎機(jī);Cyclotec 1093旋風(fēng)式樣品磨(丹麥FOSS);HY-5數(shù)顯調(diào)速多用振蕩器;TG16-WS臺(tái)式高速離心機(jī)；Milli-Q Syhthesis超純水系統(tǒng)(美國(guó)密理博)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試樣制備

大豆試樣按四分法縮分，用高速粉碎機(jī)粉碎后過(guò)Φ0.25 mm網(wǎng)篩；或者直接使用安裝了Φ0.25 mm網(wǎng)篩的旋風(fēng)式樣品磨粉碎大豆試樣。

1.2.2 杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定大豆水溶性蛋白含量

稱(chēng)取大豆試樣(1±0.1)g于50 mL離心管，加入30 mL(20±2)℃去離子水，振搖使試樣不結(jié)塊，均勻分散，然后控制溫度在(20±2)℃恒溫振蕩40 min，3 500 r/min離心10 min，將上層水溶性蛋白提取溶液轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中；再加入30 mL去離子水，重復(fù)上述恒溫振蕩、離心試驗(yàn)操作1次，將提取液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶后定容、混勻。用快速濾紙過(guò)濾至100 mL燒杯中，棄去最初的5～10 mL的濾液。準(zhǔn)確吸取濾液3～4 mL于錫箔杯中，置于150℃的電熱板上加熱蒸發(fā)、干燥，近干時(shí)加入硅藻土少許，吸附剩余水分，擠出錫箔杯中空氣后放入杜馬斯燃燒定氮儀樣品盤(pán)中分析測(cè)定。

杜馬斯儀器試驗(yàn)條件：氧化燃燒溫度980℃，還原溫度600℃，氧氣流速300 mL/min,氧氣因子1.4 mL/mg。

1.2.3 凱氏定氮法測(cè)定大豆水溶性蛋白含量

依據(jù)農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 1205—2006分析測(cè)定大豆試樣水溶性蛋白含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 凱氏定氮法分析結(jié)果

試樣“大豆-1”水溶性蛋白含量測(cè)定結(jié)果為31.95%(n=5)，試驗(yàn)精密度(RSD)為0.9%。

2.2 杜馬斯燃燒定氮法試驗(yàn)條件選擇

2.2.1 不同固液比對(duì)水溶性蛋白提取率的影響

稱(chēng)取大豆試樣1 g至50 mL離心管中，按1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50固液比，恒溫振蕩提取2次，每次提取40 min，離心后的上層水溶性蛋白提取溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，定容、混勻。同時(shí)處理5個(gè)平行試樣，用杜馬斯燃燒定氮儀按1.2.2條件進(jìn)行分析測(cè)定,結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 不同固液比時(shí)大豆水溶性蛋白試驗(yàn)結(jié)果

由表1可以看出，不同的固液比對(duì)測(cè)定結(jié)果有明顯影響。在提取過(guò)程中，大豆試樣質(zhì)量和水的比例在1∶10和1∶20時(shí)，試驗(yàn)精密度(RSD)差且大豆水溶性蛋白提取不充分；固液比在1∶30、1∶40和1∶50時(shí)，試驗(yàn)精密度(RSD)較好且大豆水溶性蛋白提取率在100%左右。

本研究在固液比1∶30、1∶40和1∶50時(shí)，準(zhǔn)確度和精密度均較好的情況下，考慮到使用50 mL提取容器的操作便捷性，同時(shí)考慮到固液比在1∶30條件下提取溶液蛋白含量最低，引入測(cè)量不確定度最小，所以固液比采用1∶30。

2.2.2 不同提取次數(shù)和提取時(shí)間對(duì)大豆水溶性蛋白提取率的影響

稱(chēng)取大豆試樣1 g，按照1∶30的固液比，采用1、2、3、4次不同的提取次數(shù)和20、40、60 min不同的提取時(shí)間處理試樣，離心后的上層水溶性蛋白提取溶液全部轉(zhuǎn)移至100 mL或200 mL容量瓶，定容，混勻，用杜馬斯燃燒定氮儀分析測(cè)定，所有設(shè)計(jì)方案均處理5個(gè)平行。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 不同提取次數(shù)和提取時(shí)間時(shí)大豆水溶性蛋白試驗(yàn)結(jié)果

由表2可以看出,隨著提取次數(shù)的增加和提取時(shí)間的延長(zhǎng)大豆水溶性蛋白的提取率也隨之增加。提取次數(shù)為1次時(shí)，提取時(shí)間20、40、60 min時(shí)的提取率分別為75.5%、86.8%、90.4%，提取率雖然逐漸提高，但60 min時(shí)仍未將目標(biāo)成分提取完全；提取次數(shù)為2次時(shí)，提取時(shí)間20 min時(shí)的提取率達(dá)到92.7%，40 min時(shí)提取率已達(dá)到100.6%，即目標(biāo)成分提取完全，60 min時(shí)提取率與40 min一致。提取時(shí)間為20 min時(shí)，提取至少3次才能達(dá)到完全提取的效果；而提取時(shí)間為40 min或60 min時(shí)，提取2次即可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)成分完全提取。

綜合考慮工作效率、試驗(yàn)準(zhǔn)確度和精密度，本研究選擇試驗(yàn)條件為：提取次數(shù)2次，提取時(shí)間40 min。

2.2.3 提取液吸取量和干燥溫度的選擇

杜馬斯燃燒法在分析過(guò)程中需要盡量去除水蒸氣，否則會(huì)影響熱傳導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)的定量結(jié)果，所以對(duì)于試驗(yàn)試樣要盡可能預(yù)干燥，使試樣處于近干狀態(tài)，更有利于分析檢測(cè)。對(duì)于本研究，要解決大豆水溶性蛋白提取溶液如何實(shí)現(xiàn)蒸發(fā)、干燥達(dá)到適宜于杜馬斯燃燒儀器分析的狀態(tài)問(wèn)題。

在大豆試樣1 g、固液比1∶30、提取次數(shù)2次、提取時(shí)間40 min的試驗(yàn)條件下，分別吸取大豆水溶性蛋白提取溶液2、3、4 mL，與干燥溫度120、150、180℃ 3個(gè)試驗(yàn)條件做交叉試驗(yàn)，將提取溶液預(yù)干燥至近干狀態(tài)，所需時(shí)間見(jiàn)表3。

表3 不同提取液吸取量和不同干燥溫度條件下所需時(shí)間

由表3可以看出，當(dāng)提取液吸取量2 mL、干燥溫度180℃時(shí)所需時(shí)間為20 min，耗時(shí)最短。但是考慮到稱(chēng)樣質(zhì)量、定容體積和大豆水溶性蛋白的含量范圍等因素，對(duì)于水溶性蛋白含量較低的大豆試樣，當(dāng)提取溶液吸取量為2 mL時(shí)會(huì)因氮元素分析質(zhì)量較小的緣故而影響試驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確度，同時(shí)也會(huì)引入較大的不確定度。當(dāng)干燥溫度設(shè)定為180℃時(shí)，對(duì)于乳濁態(tài)提取溶液會(huì)存在爆沸現(xiàn)象，會(huì)有少量溶液濺出錫箔杯，使分析結(jié)果偏低。當(dāng)干燥溫度設(shè)定為120℃時(shí)，干燥時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，影響工作效率。綜合考慮，本研究選擇試驗(yàn)條件為：提取液吸取量3～4 mL，干燥溫度150℃。

2.2.4 杜馬斯燃燒定氮儀儀器條件的選擇

杜馬斯燃燒定氮儀儀器分析時(shí)需要根據(jù)不同的試樣類(lèi)型設(shè)置不同的氧氣流速和氧氣因子兩個(gè)參數(shù)條件。以選定的大豆水溶性蛋白提取試驗(yàn)條件，設(shè)定氧氣流速為200、300 mL/min和400 mL/min，與氧氣因子1.0、1.2、1.4 mL/mg和1.6 mL/mg 4個(gè)設(shè)定條件做交叉試驗(yàn)，分析試樣大豆-1水溶性蛋白的試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 不同氧氣流速和氧氣因子下大豆水溶性蛋白分析結(jié)果(n=5)

由表4可見(jiàn)，氧氣流速和氧氣因子較低時(shí)，會(huì)導(dǎo)致大豆水溶性蛋白分析結(jié)果偏高，且試驗(yàn)精密度(RSD)較差。這可能是因?yàn)樵谘鯕饬魉俸脱鯕庖蜃虞^低條件下，氧氣供應(yīng)不足，燃燒不充分，加上本試驗(yàn)樣品與一般干基試樣比較含水量較高，燃燒過(guò)程會(huì)有部分一氧化碳?xì)怏w生成，而杜馬斯燃燒定氮儀沒(méi)有除去一氧化碳?xì)怏w的設(shè)計(jì)，一氧化碳?xì)怏w會(huì)和氮氧化物(NOX)的還原物氮?dú)庖黄疬M(jìn)入熱傳導(dǎo)檢測(cè)器(TCD)。一氧化碳和氮?dú)庠?℃時(shí)的熱導(dǎo)率系數(shù)分別為22.71×105g·J/(cm·℃·s)、23.78×105g·J/(cm·℃·s)[16]，非常接近，其與高純氦氣(He)熱導(dǎo)率系數(shù)(140.64×105g·J/(cm·℃·s),0℃)[17]的差值也較接近，被檢測(cè)器定量為氮?dú)庥?jì)算，最終導(dǎo)致大豆水溶性蛋白分析結(jié)果虛高。在氧氣流速過(guò)高(400 mL/min)及氧氣因子偏低(1.0 mL/mg)時(shí)，也會(huì)造成分析結(jié)果偏高，這可能是因?yàn)檠鯕饬魉佥^快時(shí)燃燒時(shí)間短引起的不充分燃燒所致。如果氧氣流速和氧氣因子設(shè)置過(guò)高時(shí)，超過(guò)燃燒化學(xué)計(jì)量數(shù)的氧氣(O2)會(huì)消耗還原銅粉，造成儀器部件耗材的非正常消耗。交叉試驗(yàn)結(jié)果顯示，儀器試驗(yàn)條件設(shè)定氧氣流速為300 mL/min、氧氣因子為1.2～1.6 mL/mg或氧氣流速為400 mL/min、氧氣因子為1.2～1.4 mL/mg時(shí)，試驗(yàn)結(jié)果精密度(RSD)較高、與凱氏定氮法一致性較好。

綜合考慮，本研究選擇試驗(yàn)條件為：氧氣流速300 mL/min，氧氣因子1.4 mL/mg。

2.3 本研究建立方法與凱氏定氮法的分析結(jié)果比較

以本研究建立的杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法分別測(cè)定5個(gè)大豆試樣的水溶性蛋白含量，每個(gè)試樣處理5個(gè)平行，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5。

由表5可見(jiàn)，本研究建立的分析方法與凱氏定氮法的試驗(yàn)精密度(RSD)符合《實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制規(guī)范 食品理化檢測(cè)》(GB/T 27404—2008)中“檢測(cè)方法確認(rèn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)室變異系數(shù)(CV)”的技術(shù)要求。由于杜馬斯燃燒法儀器分析實(shí)際試樣量較小的緣故，該方法的試驗(yàn)精密度略差于凱氏定氮法。對(duì)兩種分析方法的測(cè)試結(jié)果進(jìn)行t檢驗(yàn)分析，統(tǒng)計(jì)分析表明，5個(gè)大豆樣品的杜馬斯燃燒法測(cè)試結(jié)果和凱氏定氮法測(cè)試結(jié)果之間無(wú)顯著性差異(P=0.89)。

表5 本研究建立方法與凱氏定氮法的測(cè)試結(jié)果比較

2.4 討論

由試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析可以看出，本研究建立的杜馬斯燃燒定氮法的測(cè)定結(jié)果比凱氏定氮法高0.8%～1.8%。這是由于兩種方法分析原理及測(cè)定試樣中的氮元素存在形態(tài)的范圍不同所致。杜馬斯燃燒定氮法是通過(guò)高溫灼燒的方式將包括硝態(tài)氮在內(nèi)的所有形態(tài)的氮元素參與燃燒、催化并定量檢測(cè)，測(cè)定數(shù)值表征的是試樣中的所有氮元素；而凱氏定氮法在試樣消解過(guò)程中會(huì)有硝態(tài)氮逸失。所以最終試驗(yàn)結(jié)果前者略高于后者。

在我國(guó)現(xiàn)有的標(biāo)準(zhǔn)體系中，凱氏定氮法是大豆水溶性蛋白檢測(cè)現(xiàn)行有效的唯一標(biāo)準(zhǔn)方法。近幾年隨著氮元素檢測(cè)技術(shù)的不斷發(fā)展、成熟，杜馬斯燃燒定氮儀在國(guó)內(nèi)檢驗(yàn)檢測(cè)和科研機(jī)構(gòu)得到推廣應(yīng)用。而且該儀器在運(yùn)行過(guò)程中不向環(huán)境釋放有毒有害物質(zhì)，屬于環(huán)境友好型化學(xué)分析方法，是化學(xué)儀器分析未來(lái)的研究、發(fā)展趨勢(shì)。

本研究建立的杜馬斯燃燒法測(cè)定大豆水溶性蛋白的方法相對(duì)于目前的凱氏定氮法而言，因其商品化儀器設(shè)備標(biāo)配自動(dòng)進(jìn)樣器，以及其提取、蒸發(fā)、干燥、儀器分析等試驗(yàn)過(guò)程消耗時(shí)間短于凱氏定氮法提取、硫酸消解、儀器分析等所消耗的時(shí)間，所以本研究建立方法的工作效率和標(biāo)準(zhǔn)化程度優(yōu)于現(xiàn)有的凱氏定氮法。雖然本研究創(chuàng)新性地引入蒸發(fā)、干燥程序，解決了杜馬斯燃燒定氮儀只能進(jìn)樣硅藻土吸附后的0.1～0.5 mL液體試樣的局限，使提取液體試樣進(jìn)樣量達(dá)到3～4 mL，保證了試驗(yàn)結(jié)果的精密度和準(zhǔn)確性，但鑒于水溶性蛋白提取溶液的特殊性，如若能設(shè)計(jì)、研發(fā)一種專(zhuān)用性的蒸發(fā)、干燥設(shè)備，將進(jìn)一步提升該方法試驗(yàn)過(guò)程的自動(dòng)化、標(biāo)準(zhǔn)化程度。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種杜馬斯燃燒定氮法測(cè)定大豆水溶性蛋白的分析方法，該方法的試驗(yàn)精密度符合GB/T 27404—2008中“檢測(cè)方法確認(rèn)過(guò)程中實(shí)驗(yàn)室變異系數(shù)(CV)”的技術(shù)要求，與現(xiàn)行采用凱氏定氮法方法標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)定結(jié)果無(wú)顯著性差異(P=0.89)。而且該方法屬于環(huán)境友好型化學(xué)分析方法，可以滿足大豆水溶性蛋白的無(wú)污染、快速、準(zhǔn)確檢測(cè)工作。