朱 蘭，孫利民，梁家充，蘭 蓉，袁躍云，洪瓊花*

（1.云南省畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，云南昆明 650224；2.云南省畜禽遺傳資源保護(hù)和種質(zhì)創(chuàng)新工程實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650224；3.云南省家畜改良工作站，云南昆明650224）

云南省自然資源豐富，各地區(qū)多有養(yǎng)殖山羊的傳統(tǒng)，山羊是云南省畜牧業(yè)的重要組成部分，目前形成了一批具有良好生產(chǎn)性能的地方山羊品種。但隨著經(jīng)濟(jì)和社會的發(fā)展，對地方山羊品種遺傳背景的認(rèn)知缺乏致使部分品種遺傳多樣性和獨(dú)有的遺傳特性喪失，從而限制了地方品種的保護(hù)和開發(fā)。

微衛(wèi)星標(biāo)記（SSR）是研究群體之間遺傳多樣性和遺傳關(guān)系的可靠分子標(biāo)記，被廣泛應(yīng)用于畜禽分子遺傳研究中。趙艷紅等[1]用30個微衛(wèi)星座位分析了6個山羊群體的多樣性；李曉雨等[2]以波爾山羊?yàn)閰⒄昭芯?個品種山羊微衛(wèi)星標(biāo)記的遺傳多樣性；武志娟等[3]利用14個微衛(wèi)星標(biāo)記分析了云嶺黑山羊等5個群體的遺傳多樣性及親緣關(guān)系；蘭蓉等[4]應(yīng)用微衛(wèi)星技術(shù)對云嶺黑山羊等云南肉山羊黑色品系的遺傳結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析。本研究采用微衛(wèi)星分子標(biāo)記技術(shù)，以引進(jìn)品種波爾山羊作為參照群，分析彌勒紅骨山羊、圭山山羊、馬關(guān)無角山羊、師宗黑山羊、威信白山羊、龍陵黃山羊、羅平黃山羊、云嶺山羊、寧蒗黑頭山羊、昭通山羊10個地方山羊群體的遺傳多樣性，以及各山羊群體之間的遺傳分化和親緣關(guān)系，對云南省地方山羊品種的遺傳多樣性及遺傳關(guān)系作出評價，為保護(hù)云南地方山羊的遺傳資源、確定各地方品種的遺傳特性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集 采用EDTA-K2抗凝真空采血管采集云南省11個山羊群體共計637個山羊靜脈血液樣品，-20保存。品種名、樣品數(shù)量及采集地點(diǎn)如表1所示。

1.2 微衛(wèi)星引物 根據(jù)微衛(wèi)星選擇標(biāo)準(zhǔn)以及山羊微衛(wèi)星研究相關(guān)文獻(xiàn)[1-6]，從GenBank中選取15對擴(kuò)增良好的微衛(wèi)星引物對山羊樣品基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增，所選微衛(wèi)星位點(diǎn)名稱、引物序列以及退火溫度見表2，引物由上海生物工程有限公司合成。

表1 采樣信息

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑 Blood DNA Kit購自O(shè)mega Bio-Tek公司，Taq酶、dNTP、10×Buffer 購自大連寶生物有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.4 DNA提取 按Omega blood DNA kit 操作程序提取血液DNA，所獲DNA溶液保存于-20 備用。

1.5 PCR擴(kuò)增 20 μL PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系：10×緩沖液2 μL，dNTP（2.5 mmol/L）1.6 μL，上、下游引物（1 pmol/L）各 1 μL，DNA 模板（10 ng/μL）2 μL，rTaq 酶（5 U/μL）0.2 μL，dH2O 12.2 μL。PCR 反應(yīng)程序：94 預(yù)變性 10 min ；94 變性30 s，退火30 s（具體退火溫度見表2），72 延伸30 s，35個循環(huán)；72 延伸10 min，4 保存。1.6 電泳檢測 DNA提取產(chǎn)物由1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，天根生化科技有限公司的GeneRed核酸染料染色，3 μL上樣檢測DNA提取效果；PCR產(chǎn)物用12%聚丙烯酰胺凝膠3 μL，上樣、150 V電泳120 min，銀染、拍照，初步檢測擴(kuò)增效果，合格產(chǎn)物送往上海生工進(jìn)行檢測，獲得每個樣品在位點(diǎn)上的PCR產(chǎn)物片段大小數(shù)據(jù)。

表2 微衛(wèi)星位點(diǎn)參數(shù)

1.7 統(tǒng)計分析 所獲數(shù)據(jù)結(jié)合峰值模擬圖判定等位基因片段大小和基因型，經(jīng)過數(shù)據(jù)整理，用GenALEX 6計算群體各位點(diǎn)上的觀測等位基因數(shù)（Na）、有效等位基因數(shù)（Ne）、基因頻率、觀測雜合度（Ho）、期望雜合度（He）、近交系數(shù)（Fis）、遺傳變異系數(shù)（Fst）及基因流（Nm）、Nei氏遺傳距離，用CERVUS 3.0計算多態(tài)信息含量（PIC）、用MEGA 4構(gòu)建UPGMA系統(tǒng)聚類圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物聚丙烯酰胺凝膠電泳結(jié)果 11個山羊品種在15個微衛(wèi)星位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過12%聚丙烯酰胺凝膠電泳，與Marker對比后初步判定擴(kuò)增片段大小與預(yù)期相符。

圖1 BM1329 PCR產(chǎn)物12%聚丙烯凝膠電泳

2.2 位點(diǎn)遺傳多樣性分析 由表3可見，11個山羊品種在15個微衛(wèi)星位點(diǎn)上共檢測出211個等位基因，片段大小在103～269 bp；觀測等位基因介于3～14個，其中師宗黑山羊的OarFCB304的Na最高，最少的為威信白山羊、波爾山羊、彌勒紅骨山羊、龍陵黃山羊、羅平黃山羊、寧蒗黑山羊、師宗黑山羊、云嶺山羊、昭通山羊的MCM200位點(diǎn)，威信白山羊的OarAE129位點(diǎn)，波爾山羊的BM1329位點(diǎn)；Ne介于1.261～9.141，最高的為圭山山羊的BMS574位點(diǎn)，最少的為圭山山羊的MCM200位點(diǎn)。15個微衛(wèi)星位點(diǎn)Na 7.636個，介于3.182～10.091，平均 Ne為 3.555，介于 1.698～5.962。

由表4可知，位點(diǎn)的平均Ho為0.375～0.846，除MCM200外均大于0.5；平均He為0.393～0.815。

2.3 群體遺傳分化 如表5所示，11個群體平均Na最少的是威信白山羊（5.933），最多的為師宗黑山羊（8.400）；Ne最少的為威信白山羊（3.044），最多的為師宗黑山羊（3.642）；Ho最低的為彌勒紅骨山羊（0.573），最高的是師宗黑山羊（0.692）；He最低的為威信白山羊（0.608），最高的為師宗黑山羊（0.696）。師宗黑山羊的 Na、Ne、Ho、He均最高。Ho與 He差異最大的是彌勒紅骨山羊，最小的是師宗黑山羊。11個群體的Shannon指數(shù)（I）范圍在1.213～1.489，威信白山羊群體最低，師宗黑山羊最高。Fis值介于-0.025～0.146，除馬關(guān)無角山羊的Fis值為負(fù)數(shù)，其余10個群體的Fis值均為正，其中最大的是彌勒紅骨山羊，最小的是師宗黑山羊。

如表6所示，15個微衛(wèi)星位點(diǎn)PIC在0.372～0.861，平均0.717。除位點(diǎn)MCM200為中度多態(tài)外，其余位點(diǎn)均大于0.5，為高度多態(tài)。11個群體的平均PIC在0.562～0.655，均大于0.5，顯示出群體具有高度的多態(tài)性。其中威信白山羊的多態(tài)性最低（0.562），師宗黑山羊最高（0.655）。

如表7所示，波爾山羊和其他山羊群體的Fst都超過了0.05；羅平黃山羊與其他山羊群體（除波爾山羊、圭山山羊和紅骨山羊）間的Fst值均小于0.05；威信白山羊和昭通山羊的Fst小于0.05；圭山山羊、彌勒紅骨山羊、馬關(guān)無角山羊3個品種相互間的Fst小于0.05；剩余其他群體間的Fst均大于0.05。

如表7所示，群體間Nm變化范圍在1.315～10.856，均大于1；昭通山羊與羅平黃山羊之間的Nm最大，波爾山羊與云嶺山羊之間的Nm最小。

如表8所示，波爾山羊和云嶺山羊的遺傳距離最遠(yuǎn)，遺傳一致度最低；昭通山羊和羅平黃山羊的遺傳距離最近，遺傳一致度最高。由圖2可知，11個山羊群體分為兩大支，波爾山羊單獨(dú)為一支，其他地方山羊品種聚為一支。10個地方山羊群體又分為2支，其中圭山山羊和馬關(guān)山羊聚在一起，再與彌勒紅骨山羊聚為一支；另一分支包含了剩下的7個山羊品種，其中羅平黃山羊、昭通山羊、云嶺黑山羊、龍陵黃山羊、寧蒗黑頭山羊聚為一支后，再與威信白山羊聚為一支，最后師宗黑山羊再與這個分支聚為一大分支。

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表5 11個山羊群體的遺傳變異

3 討 論

3.1 微衛(wèi)星座位 群體遺傳多樣性的主要評估指標(biāo)包括Ne、He和 PIC等。本研究篩選的15個微衛(wèi)星位點(diǎn)平均Na為7.261，平均He大于0.5，具有較高的多態(tài)性。根據(jù)Bostein等[7]提出的PIC評價標(biāo)準(zhǔn)，除MCM200為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.5）外，其余位點(diǎn)均具有高度多態(tài)性（PIC＞0.5），是良好的遺傳多樣性分析分子標(biāo)記。所有位點(diǎn)的Na大于Ne，He高于Ho（BM5674位點(diǎn)除外），表明等位基因在群體中的分布可能處于不平衡狀態(tài)。

表6 11個山羊群體15個微衛(wèi)星位點(diǎn)的PIC

表7 11個山羊群體間Fst及Nm

表8 11個山羊群體間遺傳距離和遺傳一致度

圖2 11個山羊群體UPGMA聚類圖

3.2 群體內(nèi)的遺傳變異 11個山羊品種的平均Na和Ne差異較大。Hines等[8]研究表明，15個等位基因在各群體的分布并不均勻，山羊群體受到了地理隔離或者人工選育，這與各山羊品種實(shí)際遺傳育種背景不同的情況相符。

基因雜合度是度量群體遺傳變異的一個最適參數(shù)，可以反映群體的一致度，He越高，群體的遺傳變異越豐富，另外群體Ho越接近He，表明該群體受外來選擇及近交等因素的影響越小，群體處于遺傳平衡狀態(tài)[9]?；陔s合度計算的Fis反映了群體內(nèi)的基因異質(zhì)化程度，即是群體雜合度缺失程度，代表群體內(nèi)的近交程度。當(dāng)Fis出現(xiàn)正值時，表明群體內(nèi)存在近交；反之，取值為負(fù)值時，群體內(nèi)存在遠(yuǎn)交[10]。本次研究的11個山羊群體，遺傳變異最為豐富的是師宗黑山羊，最低的是威信白山羊。除馬關(guān)無角山羊外，11個群體的Ho均小于He，說明各地方品種都存在雜合體缺失的情況，這其中受到人工選擇影響最大的是彌勒紅骨山羊，最小的是師宗黑山羊。而馬關(guān)無角山羊Ho大于He，說明個體自交率較低，品種受外界影響比較大。結(jié)合Fis結(jié)果可知，師宗黑山羊品種內(nèi)的近交程度最小。彌勒紅骨山羊群內(nèi)近交程度最大，馬關(guān)無角山羊存在遠(yuǎn)交現(xiàn)象。

PIC是衡量群體基因豐富程度的一個指標(biāo)，Shannon信息指數(shù)可以反映群體遺傳變異的高低，Shannon信息指數(shù)越大，表明群體遺傳變異越大[11]。本次研究的11個群體PIC均大于0.5，Shannon指數(shù)均大于1。表明云南省地方山羊品種具有豐富的遺傳多樣性，這其中遺傳多樣性最豐富的是師宗黑山羊，最低的是威信白山羊。該結(jié)果與雜合度的分析結(jié)果相一致。

3.3 群體間的遺傳變異 Fst反映了群體間的遺傳分化程度。 Wright[12]認(rèn)為，若Fst在0～0.05時，表示各種群間幾乎不存在分化， 0.05～0.15為中度分化，0.15～0.25為高度分化。根據(jù)計算結(jié)果，波爾山羊與其他山羊群體的遺傳分化屬于中度分化，作為參照群與云南其他地方山羊品種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)；圭山山羊、彌勒紅骨山羊和馬關(guān)無角山羊三者兩兩之間都屬于輕度分化，羅平黃山羊和6個山羊品種（威信白山羊、龍陵黃山羊、寧蒗黑頭山羊、云嶺山羊、師宗黑山羊、昭通山羊）間存在輕度分化，威信白山羊和昭通山羊群體存在輕度分化，這些群體間的親緣關(guān)系較近，產(chǎn)生差異的主要原因來自于內(nèi)部變異；剩余群體之間都具有中度分化特征，具有較為明顯的不同的品種特征。

Wright[12]認(rèn)為，Nm小于1時，群體可能走向遺傳分化，Nm大于1時就能發(fā)揮均質(zhì)化作用，即能有效抑制由遺傳漂變而引起的遺傳分化。波爾山羊與云南地方山羊群體的Nm都相對較小，說明云南地方山羊群體與波爾山羊基因交流較少；10個地方山羊品種之間的Nm均大于2，說明品種之間的基因交流比較多，這其中昭通山羊與羅平黃山羊之間的Nm最大，可能在育種歷史中存在有較多的基因交流。

遺傳距離是以2個群體或2個物種間在同一基因座位上等位基因的頻率來計算群體遺傳差異的指標(biāo)，可用于描述品種間的遺傳變異。遺傳距離是表示群體間親緣關(guān)系遠(yuǎn)近的常用指標(biāo)，一般認(rèn)為群體分化的時間越短，遺傳距離越小[13]。根據(jù)Nei氏遺傳距離的計算結(jié)果，昭通山羊與羅平黃山羊的距離最短，說明二者的分化時間最短，波爾山羊與云嶺山羊的分化時間最長。聚類分析結(jié)果表明，波爾山羊作為外來引進(jìn)品種，與其他云南地方山羊群體分化明顯，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，符合實(shí)驗(yàn)預(yù)期和實(shí)際育種生產(chǎn)背景，說明本次研究所采取的實(shí)驗(yàn)方法取得的數(shù)據(jù)較為可靠。 其余10個云南地方山羊品種中，彌勒紅骨山羊，圭山山羊和馬關(guān)無角山羊單獨(dú)聚為第一小分支，遺傳關(guān)系較為接近；第二小分支中，羅平黃山羊、昭通山羊、云嶺山羊、龍陵黃山羊和寧蒗黑山羊的親緣關(guān)系更為接近。師宗黑山羊更早的分成獨(dú)立一支，與第二小分支的其余山羊群體遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。這個結(jié)果顯示品種的遺傳關(guān)系遠(yuǎn)近與山羊毛色和地理分布沒有絕對關(guān)聯(lián)，親緣關(guān)系較近的品種可能具有遺傳背景更為接近的祖先。

綜上，師宗黑山羊的群內(nèi)遺傳多樣性較高，與其他地方品種之間的遺傳分化較為明顯，具有較高的保種潛力。威信白山羊群內(nèi)遺傳程度較低，應(yīng)避免育種過程中遺傳多樣性的丟失。羅平黃山羊、昭通山羊、云嶺山羊、龍陵黃山羊和寧蒗黑山羊間的遺傳分化不明顯，親緣關(guān)系較近，基因交流較大，應(yīng)加強(qiáng)選育，形成更為明顯的品種遺傳特征。彌勒紅骨山羊群內(nèi)近交程度較高，可能是由于種群變小，在育種中應(yīng)選擇優(yōu)質(zhì)后代，避免近交衰退。彌勒紅骨山羊與圭山山羊之間幾乎不存在遺傳分化，這與之前的研究具有一致性[14]。馬關(guān)無角山羊的遠(yuǎn)交現(xiàn)象可能是造成其遺傳關(guān)系與圭山山羊相近的原因，在今后的品種培育中應(yīng)加強(qiáng)繁育個體遺傳背景的篩選，避免品種遺傳特征流失。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，這11個山羊品種遺傳多樣性較高，具有選育提高的巨大潛力；各品種間存在不同程度的遺傳分化和基因交流，通過UPGMA聚類分析對11個山羊品種的親緣關(guān)系作出了評價。