秦羽楓，陳方博，張桂林，程鵬飛2，*，肖 鵬，李守淳*

（1.江西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，南昌 330027；2.九江學(xué)院化學(xué)與環(huán)境工程學(xué)院，江西 九江 332005；3.寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波 315211;4.江西省九江市濂溪區(qū)農(nóng)業(yè)局，江西 九江 332005）

隨著沼氣工程的發(fā)展，畜禽養(yǎng)殖業(yè)糞污資源化取得了明顯的成效。但是在提供清潔能源的同時(shí)，也產(chǎn)生了大量的沼渣和沼液廢水。大量富營(yíng)養(yǎng)的豬糞沼液廢水對(duì)水體環(huán)境以及人類(lèi)健康都造成了嚴(yán)重危害[1-2]。豬糞沼液廢水是一種較難處理的有機(jī)廢水，除了富含N、P等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)外，還有少量重金屬、抗生素等成分。未得到妥善處理的豬糞沼液會(huì)導(dǎo)致水體富營(yíng)養(yǎng)化、人類(lèi)飲用水源污染等問(wèn)題，嚴(yán)重破壞水體生態(tài)環(huán)境[3]。

目前處理沼液廢水的方法主要有還田應(yīng)用、物理化學(xué)法及厭氧發(fā)酵等工藝[4-5]。還田應(yīng)用在一定程度上實(shí)現(xiàn)了畜禽糞污的資源化利用，但農(nóng)田作物對(duì)畜禽糞污的接納能力有限，不能與畜禽排放量完全同步，進(jìn)而引起水體及土壤累積性污染。物理化學(xué)法與厭氧發(fā)酵技術(shù)雖然能去除沼液廢水中部分有機(jī)、無(wú)機(jī)污染物，但對(duì)沼液廢水中的N、P等大量物質(zhì)的去除效果不明顯，并且具有成本高、不易操作等缺點(diǎn)[6]。

微藻是一種單細(xì)胞光合自養(yǎng)生物，其生長(zhǎng)所需要的營(yíng)養(yǎng)成分較為簡(jiǎn)單，可利用沼液廢水中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生長(zhǎng)[7]。利用微藻凈化污水或處理豬糞沼液廢水的技術(shù)已得到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可[8]。微藻在處理沼液廢水過(guò)程中，由于自身細(xì)胞的增殖與營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累，在降低培養(yǎng)基成本的同時(shí)也實(shí)現(xiàn)了沼液廢水的無(wú)害化、資源化利用[9]。但實(shí)際情況中養(yǎng)豬沼液過(guò)高濃度的NH+4-N超出了微藻的耐受性，抑制了藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。Min等[10]通過(guò)淡水稀釋的方法降低NH+4-N濃度，Deng等[11]利用厭氧消化預(yù)處理降低NH+4-N濃度，均達(dá)到了一定的效果。但這些技術(shù)手段在應(yīng)用中卻面臨高成本等問(wèn)題。因此，利用藻類(lèi)處理養(yǎng)豬沼液還需進(jìn)一步研究[12]。

養(yǎng)豬沼液成分復(fù)雜，富含COD、有機(jī)物等物質(zhì)，導(dǎo)致水體的光強(qiáng)和光質(zhì)隨著水體透明度發(fā)生變化，抑制甚至損害藻類(lèi)的生長(zhǎng)。光是調(diào)控藻類(lèi)植物生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因子之一，藻類(lèi)對(duì)可見(jiàn)光的吸收波長(zhǎng)主要集中在400～510 nm的藍(lán)紫光區(qū)和610～720 nm的紅橙光區(qū)。大量研究發(fā)現(xiàn)光質(zhì)對(duì)藻類(lèi)的生長(zhǎng)發(fā)育、形態(tài)、光合作用和物質(zhì)代謝等具有重要的調(diào)控作用，如蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）在藍(lán)光下的生長(zhǎng)效果最佳[13]，而紅光則能促進(jìn)等鞭金藻的藻細(xì)胞生長(zhǎng)[14]。光質(zhì)是光的重要屬性，因此光質(zhì)應(yīng)被優(yōu)先考慮。探究不同光質(zhì)條件對(duì)藻類(lèi)處理養(yǎng)豬沼液廢水的影響具有一定的理論意義。

在藻類(lèi)培養(yǎng)處理沼液廢水過(guò)程中NH+4-N濃度是限制微藻-沼液資源化利用的重要因素。利用藻類(lèi)培養(yǎng)深度凈化沼液廢水，解決廢水中高濃度-N問(wèn)題很關(guān)鍵。微藻在處理N同時(shí)也為自身生長(zhǎng)提供氮源，而銨鹽是藻細(xì)胞優(yōu)先利用的氮源，在氮吸收調(diào)節(jié)過(guò)程中起到重要作用[15]。由于實(shí)際豬業(yè)養(yǎng)殖過(guò)程中，豬飼料Cu元素的存在可以促進(jìn)豬腸道對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的吸收，而豬本身卻對(duì)Cu2+的吸收率僅為10%左右，大部分Cu2+隨豬尿排出[16]。因此，Cu2+是養(yǎng)豬沼液廢水中普遍存在的金屬元素。藻類(lèi)去除重金屬的機(jī)制比較明確，但沼液廢水中存在的一些金屬元素是否影響N在藻細(xì)胞內(nèi)的吸收代謝目前尚不清楚，還需進(jìn)一步研究。

基于上述背景，本文以篩選得到耐污能力強(qiáng)的柵藻（Scenedesmus obliquus）為研究對(duì)象，采集江西九江境內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)厭氧發(fā)酵后的典型沼液廢水，研究不同光質(zhì)條件（紅光、藍(lán)光、白光）對(duì)柵藻處理沼液廢水的影響。同時(shí)以養(yǎng)豬沼液中-N、Cu2+濃度為參照，在BG11培養(yǎng)基中考察不同濃度的-N及金屬Cu2+對(duì)柵藻生長(zhǎng)的影響，以期為微藻-沼液廢水資源化利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 藻種與培養(yǎng)基

本實(shí)驗(yàn)所用柵藻（Scenedesmus obliquus）由實(shí)驗(yàn)室篩選并馴化保藏。柵藻種子液培養(yǎng)及-N、Cu2+濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基為BG11培養(yǎng)基[17]。

柵藻培養(yǎng)所用反應(yīng)器為玻璃柱式反應(yīng)器，內(nèi)直徑0.05 m，柱高0.55 m，反應(yīng)體積0.9 L。反應(yīng)器內(nèi)部布置直徑5 mm的玻璃通氣管，混合有1.5%CO（2V/V）的壓縮空氣（0.1 MPa）以100 mL·min-1的速率通過(guò)通氣管從反應(yīng)器底部曝氣，使藻液攪動(dòng)并補(bǔ)充碳源。前期研究證實(shí)，光照強(qiáng)度 80～100 μmol photons·m-2·s-1下柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)較好。為了考察柵藻生長(zhǎng)最高效率，柵藻培養(yǎng)過(guò)程中連續(xù)光照，培養(yǎng)柱表面光強(qiáng)100 μmol photons·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度（25±1）℃。

1.2 沼液廢水

本文柵藻培養(yǎng)所用沼液廢水取自江西九江境內(nèi)某養(yǎng)殖場(chǎng)經(jīng)厭氧發(fā)酵后的典型沼液廢水，取水時(shí)間為2017年9月12日10：00。廢水經(jīng)自然沉降2 d后，取上清液測(cè)定其初始氨氮（NH+4-N）、Cu2+、總磷（TP）、COD等指標(biāo)，結(jié)果見(jiàn)表1。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.3.1 不同光質(zhì)條件對(duì)柵藻處理沼液廢水的影響

表1 沼液廢水的參數(shù)指標(biāo)（mg·L-1）Table 1 The features of the raw piggery wastewater（mg·L-1）

本實(shí)驗(yàn)以稀釋兩倍的養(yǎng)豬沼液廢水作為柵藻培養(yǎng)液。取自然沉降后的沼液上清液1000 mL，再加入1000 mL蒸餾水，制成培養(yǎng)液。將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)期的柵藻種子液接入配制好的培養(yǎng)液中，在玻璃柱式反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。在LED光源儀器下接受不同光質(zhì)（藍(lán)光、紅光、白光）條件的培養(yǎng)，其中藍(lán)光波長(zhǎng)范圍為455～475 nm，紅光波長(zhǎng)范圍為580～630 nm，白光波長(zhǎng)范圍為400～760 nm，采用連續(xù)光照，光照強(qiáng)度均為 100 μmol·m-2·s-1，培養(yǎng)溫度為（25±1）℃。每2 d稱(chēng)量藻體生物量，重復(fù)3次，培養(yǎng)周期為10 d。

同時(shí)，在不同光質(zhì)條件培養(yǎng)過(guò)程中取培養(yǎng)液，分別測(cè)定2、4、6、10 d的培養(yǎng)液中-N濃度變化情況。NH+4-N測(cè)量采用納氏試劑分光光度法（HJ 535—2009）。

1.4 藻細(xì)胞生物量測(cè)定與生物產(chǎn)率計(jì)算

將孔徑0.45 μm、直徑50 mm、面積為0.001 m2的醋酸纖維濾膜煮沸3次后，在105℃烘箱中烘至恒質(zhì)量（W1），將待測(cè)藻細(xì)胞用移液器取15 mL藻樣到抽濾裝置內(nèi)，抽濾至已稱(chēng)質(zhì)量的濾膜上，將附著藻的濾膜放入105℃烘箱中烘至恒質(zhì)量（W2），用分析天平稱(chēng)量，并計(jì)算藻細(xì)胞的生物量（DW，g·L-1）。

DW=（W2-W1）/15

基于本研究培養(yǎng)時(shí)間為10 d，柵藻生物產(chǎn)率（BP，g·L-1·d-1）計(jì)算公式如下：

BP=DW/10

1.5 數(shù)據(jù)分析方法

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 10.0進(jìn)行單因素方差分析（One-way ANOVA）。

2 結(jié)果與分析

2.1 紅光、藍(lán)光、白光條件下沼液廢水培養(yǎng)柵藻生長(zhǎng)及-N去除效果

培養(yǎng)10 d后測(cè)定柵藻的生長(zhǎng)情況，結(jié)果如圖1所示，在3種光質(zhì)條件下柵藻均能在沼液廢水中生長(zhǎng)，但在藍(lán)光和紅光下的生長(zhǎng)狀況不佳，尤其是培養(yǎng)至后期，藻細(xì)胞增長(zhǎng)趨于平緩。而白光條件下藻細(xì)胞的生長(zhǎng)速率最快，明顯高于藍(lán)光和紅光，其生物產(chǎn)率分別為0.21、0.04、0.03 g·L-1·d-1。

在光照強(qiáng)度100 μmol·m-2·s-1的不同光質(zhì)條件下培養(yǎng)柵藻，經(jīng)測(cè)定，稀釋1倍后的沼液中N濃度為326 mg·L-1。一個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)測(cè)定的培養(yǎng)液中-N濃度見(jiàn)圖2。由圖2可知，相同培養(yǎng)條件中，白光光質(zhì)條件下柵藻去除沼液廢水中N能力最強(qiáng)，由初始的N濃度326 mg·L-1降到29 mg·L-1，去除率為91.1%。不同取樣時(shí)間下，藍(lán)光和紅光光質(zhì)條件中的-N濃度變化不大，培養(yǎng)10 d后去除效率分別為72.4%和66.9%。對(duì)比圖1與圖2可知，柵藻在不同光質(zhì)條件下對(duì)沼液廢水中-N去除效率與柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況相對(duì)應(yīng)。

2.2 不同-N濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)的影響

2.3 不同Cu2+濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)的影響

不同Cu2+濃度對(duì)柵藻生長(zhǎng)的影響結(jié)果如圖4所示。由圖4a可知，在培養(yǎng)前4 d內(nèi)柵藻在不同Cu2+濃度下生長(zhǎng)速率與正常培養(yǎng)基相差不大。隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)10 d時(shí)，Cu2+濃度越高柵藻生物產(chǎn)率越低，0.5、1.0、2.0 mg·L-1Cu2+濃度分別為0.18、0.15、0.13 g·L-1·d-1，都低于正常培養(yǎng)下的生物產(chǎn)率0.19 g·L-1·d-1。因此，養(yǎng)豬沼液中存在的金屬Cu2+也是限制藻類(lèi)生長(zhǎng)的重要因素。

2.4 不同Cu2+濃度對(duì)柵藻適應(yīng)NH+4-N的影響

圖1 不同光質(zhì)條件下柵藻在沼液廢水中的生長(zhǎng)狀況Figure 1 The growth of Scendesmus dimorphus with different light qualities in swine wastewater

圖2 不同光質(zhì)條件下沼液廢水中-N濃度變化Figure 2 Concentrations and removal efficiency of -N with different light qualities in swine wastewater

圖3 -N對(duì)柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 3 Effects of ammonia nitrogen on growth of Scenedesmus obliquus

以沼液廢水中506 mg·L-1NH+4-N濃度為標(biāo)準(zhǔn)，在BG11培養(yǎng)基中設(shè)置500 mg·L-1的NH+4-N濃度，然后將柵藻分別培養(yǎng)于額外添加Cu2+濃度0.5、1.0、2.0 mg·L-1的培養(yǎng)液中。培養(yǎng)10 d后，結(jié)果（圖5）表明，添加Cu2+濃度0.5、1.0 mg·L-1的培養(yǎng)液中柵藻生物產(chǎn)率分別為0.18、0.19 g·L-1·d-1，與正常培養(yǎng)基相近。而高Cu2+濃度（2.0 mg·L-1）下，柵藻生長(zhǎng)較差，生物產(chǎn)率為0.13 g·L-1·d-1。但將圖 5與圖 4b比較表明，一定的-N存在下，柵藻能耐受較高的Cu2+濃度。

3 討論

光是藻類(lèi)生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中重要的環(huán)境因子之一。本研究將柵藻分別置于不同光質(zhì)條件（白光、紅光、藍(lán)光）的沼液廢水中培養(yǎng)，結(jié)果顯示柵藻在白光下生長(zhǎng)狀況要顯著優(yōu)于其他兩類(lèi)光質(zhì)條件。這說(shuō)明不同波長(zhǎng)的光源會(huì)影響柵藻細(xì)胞組分在沼液廢水中的合成。同樣，相比于其他兩種光質(zhì)，白光條件下柵藻對(duì)沼液廢水中NH+4-N去除效率更高。不同光質(zhì)條件對(duì)不同藻類(lèi)的生長(zhǎng)影響不同，這主要是因?yàn)椴煌宸N門(mén)類(lèi)其色素體結(jié)構(gòu)與組成不同，微藻光合細(xì)胞中捕獲光能主要由光合色素完成，所以光環(huán)境（包括光質(zhì)）的改變對(duì)微藻光合色素形成具有重要影響[18-20]?？赡芑诠赓|(zhì)條件對(duì)柵藻細(xì)胞形態(tài)建成、光合特性及生理代謝等廣泛的調(diào)控作用[21]，柵藻在白光光質(zhì)下培養(yǎng)并處理養(yǎng)豬沼液是相對(duì)較好的條件。

圖4 Cu2+對(duì)柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)的影響Figure 4 Effects of copper on growth of Scenedesmus obliquus

圖5 -N存在下Cu2+對(duì)柵藻生長(zhǎng)的影響Figure 5 Effects of copper on growth of Scenedesmus obliquus with ammonia nitrogen coexistence

金屬Cu2+在養(yǎng)豬沼液中存在是因?yàn)镃u2+等金屬元素在預(yù)防和治療疾病、促進(jìn)豬生長(zhǎng)以及提高飼料利用效率等方面發(fā)揮了顯著的作用，成為養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)不可或缺的金屬元素。然而，豬等畜禽對(duì)Cu2+等金屬元素的吸收效率很低，大部分隨尿液排出，這也是養(yǎng)豬沼液中重金屬Cu2+存在的主要原因[16]。在一定濃度范圍內(nèi)，藻類(lèi)在響應(yīng)重金屬脅迫過(guò)程中，會(huì)建立起一系列的適應(yīng)機(jī)制，通過(guò)控制重金屬吸收、吸附、轉(zhuǎn)運(yùn)、解毒，使藻細(xì)胞組分中的重金屬維持在正常濃度范圍。但當(dāng)培養(yǎng)液中金屬濃度過(guò)高時(shí)就會(huì)抑制藻細(xì)胞的生長(zhǎng)。這也印證了本研究中當(dāng)培養(yǎng)基Cu2+濃度大于1.0 mg·L-1后，柵藻細(xì)胞生長(zhǎng)速率變緩，生物產(chǎn)率低于正常培養(yǎng)及低濃度Cu2（+0.5 mg·L-1）下的生物產(chǎn)率（圖4）。

利用藻類(lèi)培養(yǎng)處理養(yǎng)豬沼液的研究需要考慮眾多因素的影響[26]。本研究主要側(cè)重于沼液中存在的主要物質(zhì)N與Cu2+兩種因素，考察它們同時(shí)存在下對(duì)藻類(lèi)培養(yǎng)的影響。通過(guò)比較圖3與圖4發(fā)現(xiàn)：相比于單因素金屬Cu2+存在下（圖4），柵藻在含高濃度-N沼液中更能耐受較高的Cu2+濃度。這或許說(shuō)明一定的-N濃度促進(jìn)了柵藻對(duì)Cu2+的富集或吸收。藻類(lèi)去除重金屬的機(jī)制比較明確，但沼液廢水中存在的一些金屬元素是否影響-N在細(xì)胞內(nèi)的代謝目前尚不清楚，后續(xù)還需進(jìn)一步研究。利用藻類(lèi)培養(yǎng)處理養(yǎng)豬沼液廢水，既可降低藻類(lèi)的培養(yǎng)成本，又可凈化廢水，保護(hù)生態(tài)環(huán)境，是一條資源化利用的途徑。

4 結(jié)論