張?zhí)煨瘢瑢O金生，張秋英，凌郡鴻，閆振廣，何歡祺

（1.天津市動植物抗性重點實驗室,天津師范大學生命科學學院，天津 300387；2.中國環(huán)境科學研究院，環(huán)境基準與風險評估國家重點實驗室，北京 100012）

據(jù)2016年《中國環(huán)境狀況公報》，氨氮在我國地表水中廣泛存在，是我主要流域的重要污染指標之一。氨氮對水生生物的毒性效應自二十世紀七八十年代就受到廣泛關注[1-2]，水體溫度和pH值能顯著影響氨氮的生物毒性，在一定水質(zhì)條件下，氨氮可以體現(xiàn)出較大的毒性效應。水體中氨氮主要以兩種形式存在：非離子氨（NH3）和銨離子（），相對毒性較小，NH3是中性分子，與相比更容易擴散穿過生物細胞膜[3]，因此是氨氮對水生生物致毒的主要要素[4]，能影響水生生物的游泳行為、生長性能、呼吸及代謝、滲透調(diào)節(jié)和機體免疫力等，嚴重時可導致生物死亡[5]。

19世紀末，俄國衛(wèi)生學家提出環(huán)境質(zhì)量基準的概念[6]。美國是世界上最早開始水環(huán)境質(zhì)量基準研究的國家之一，于20世紀初開展了一些污染物對魚類等生物的毒性效應研究[7-8]，后續(xù)真正開展了水環(huán)境基準研究，陸續(xù)發(fā)布了較為成熟的各類水環(huán)境基準相關技術規(guī)范[9-10]。貝類是水生生態(tài)系統(tǒng)中重要的生物類群之一，對維持水生態(tài)系統(tǒng)完整性具有重要作用[11-12]。貝類也是制定水質(zhì)基準時重要的受試生物之一[13]。美國EPA在氨氮水質(zhì)基準研究中發(fā)現(xiàn)貝類對氨氮的物種敏感性最高，為充分保護貝類，于2013年重新修訂了氨氮水質(zhì)基準文件[14]。

我國現(xiàn)行水質(zhì)標準主要依據(jù)國外水質(zhì)基準和標準確定，但流域水質(zhì)特征與本土生物分布的不同會造成環(huán)境基準適用性的明顯差異[14]，因此本土水質(zhì)基準研究對于保護我國生態(tài)環(huán)境具有重要意義。水生生物對污染物敏感性的分析是研究水質(zhì)基準的基礎，我國學者基于本土生物分布特征對遼河[15]和太湖[16]的氨氮水質(zhì)基準進行了初步研究，但尚未見對氨氮的物種敏感度分布的詳細分析。

本文開展了氨氮對我國本土貝類河蜆（Corbicula fluminea）和中華圓田螺（Cipangopaludina cahayensis）的急性毒性試驗，綜合文獻數(shù)據(jù)對我國和美國物種的氨氮物種敏感度分布進行分析，為我國氨氮水質(zhì)基準和標準研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗物種：河蜆、中華圓田螺購自市場，河蜆殼長（1.5±0.2）cm，殼高（1.0±0.2）cm，中華圓田螺殼高（2.3±0.2）cm，殼寬（1.3±0.2）cm，實驗室暫養(yǎng)后進行試驗。將試驗用河蜆置于曝氣水中馴養(yǎng)1周以上，馴養(yǎng)水質(zhì)條件與試驗水質(zhì)條件保持一致，定時、定量投喂綠藻，試驗前1 d停止喂食。選取大小均一的健康個體為試驗對象。

試驗用水：將自來水經(jīng)72 h充分曝氣除氯后使用，pH 8.2～8.5，總硬度（CaCO3計）180 mg·L-1，溶解氧不低于6 mg·L-1，總有機碳小于5 mg·L-1。

試驗試劑：氯化銨購自國藥集團化學試劑有限公司（分析純，含量≥99.5%）。

1.2 試驗方法

河蜆和中華圓田螺的急性毒性試驗方法參考ASTM貝類毒性試驗技術導則[17]進行，根據(jù)Liu等[18]氨氮生物毒性試驗的過程和氨氮濃度檢測結果，本研究采用半靜態(tài)試驗，試驗期間每隔12 h吸污一次，每24 h更新試驗溶液，以保證更新溶液前后氨氮的濃度差異小于20%，符合技術指南的要求。

河蜆的氨氮預試驗濃度設置為10、50、100、200 mg N·L-1，中華圓田螺的氨氮預試驗濃度設置為100、200、400、800 mg N·L-1，每個濃度7個樣本，不設重復。根據(jù)預實驗結果（河蜆LC50在10～100 mg N·L-1之間，中華圓田螺LC50在200～400 mg N·L-1之間），河蜆的氨氮正式試驗濃度設置為20.0、28.0、39.2、54.9、76.8、108、151 mg N·L-1，中華圓田螺的氨氮正式試驗濃度設置為174、208、250、300、360、432、518、622 mg N·L-1，均設一個空白對照組，每組試驗3個平行，每個平行7個樣本。

每日觀察貝類存活狀況并記錄異常行為，試驗中及時撈出死亡個體，分別于24、48、72、96 h記錄貝類死亡情況。

1.3 試驗數(shù)據(jù)處理

氨氮對河蜆和中華圓田螺的急性毒性測試終點為96-h LC50，采用直線回歸法[19]計算氨氮的LC50，及其95%置信區(qū)間，數(shù)據(jù)分析采用SPSS 22.0軟件。線性回歸分析后對回歸方程進行顯著性檢驗。進行中美毒性數(shù)據(jù)對比分析前，根據(jù)美國EPA推薦的pH值關系式對毒性數(shù)據(jù)進行轉換，統(tǒng)一調(diào)整到pH為7.0、T=20℃水質(zhì)條件下[14]。

1.4 數(shù)據(jù)篩選與分析

文獻毒性數(shù)據(jù)來源包括美國EPA的ECOTOX（http：//epa.gov/ecotox/）毒性數(shù)據(jù)庫、美國氨氮基準文件[14]、中國知網(wǎng) CNKI（http：//www.cnki.net/）和公開發(fā)表的文獻，搜索時按關鍵詞（急性毒性、氨氮、物種敏感度等）進行全網(wǎng)查詢，并按照如下原則進行篩選。

試驗數(shù)據(jù)要求[14，16]：①急性毒性數(shù)據(jù)終點選擇LC50或EC50，慢性毒性數(shù)據(jù)終點選擇無可見效應濃度（NOEC）、最低可見效應濃度（LOEC）、EC10等；②溞或其他枝角類和搖蚊幼蟲的急性毒性試驗暴露時間選擇48 h，魚類及其他動物的急性暴露時間選擇96 h，單細胞動物的毒性試驗數(shù)據(jù)不予采用；③急性毒性試驗過程不能喂食；④稀釋用水的總有機碳或顆粒物質(zhì)量濃度應小于5 mg·L-1；⑤對于同一個物種或同一個終點有多個毒性值可用時，使用幾何平均值；⑥將不符合水質(zhì)基準計算要求的試驗數(shù)據(jù)剔除，如無對照試驗的數(shù)據(jù)、未報導試驗pH值和溫度的數(shù)據(jù)、試驗稀釋用水不合格的數(shù)據(jù)、試驗設計不規(guī)范的數(shù)據(jù)及可疑數(shù)據(jù)等；⑦同種或同屬的急性毒性數(shù)據(jù)如果差異過大，應被判斷為有疑點的數(shù)據(jù)而謹慎使用。

氨氮毒性顯著受到水體溫度和pH值的影響，根據(jù)EPA氨氮基準文件的數(shù)據(jù)調(diào)整方法[14]，將獲得的氨氮文獻毒性數(shù)據(jù)統(tǒng)一調(diào)整為pH=7、T=20℃時的數(shù)據(jù)。調(diào)整后對數(shù)據(jù)進行分析，求得各個物種的種平均急性值（Species mean acute value，SMAV）和平均慢性值（Species mean chronic value，SMCV），SMAV/SMCV等于同一物種的毒性值的幾何平均值；然后對全部物種的SMAV/SMCV從小到大進行排序。依據(jù)我國發(fā)布的《淡水水生生物水質(zhì)基準制定技術指南》（HJ 831—2017）[20]對中美氨氮水質(zhì)基準進行推算。本研究中氨氮數(shù)值均以氮的含量表示。對中美物種對氨氮的物種敏感度進行對比分析，包括全部物種對比分析和對魚、貝、甲殼類生物進行分類對比分析等。數(shù)據(jù)分析及畫圖采用Origin 8.0軟件。

1.5 氨氮毒性數(shù)據(jù)調(diào)整方法

在水溶液中，氨氮主要以兩種形式存在：非離子氨（NH3）和銨離子（NH+4），二者處于平衡狀態(tài)：

溫度對平衡常數(shù)K有顯著影響，據(jù)Emerson等[21]的研究，這種關系為：

式中：T表示實驗溫度，℃。毒性濃度（AV）根據(jù)總氨（TA）計算為：

根據(jù)在TA表示下求出的AV轉換為在總氨氮（TAN）表示下的毒性濃度（AVt）：

將實驗pH下的AVt轉換到標準測試pH=7時的轉換公式

僅限無脊椎動物的溫度調(diào)整公式，毒性值AVt在pH=7時根據(jù)TAN表示為AVt，7，轉換到標準測試溫度（T=20 ℃）時使用以下公式即可求出AVt，7，20。

lg（AVt，7，20）＝lg（AVt，7）-[-0.036（19 ℃-20 ℃）]

2 結果與分析

2.1 氨氮對兩種本土貝類的急性毒性試驗

96 h急性毒性預試驗結果顯示，河蜆和中華圓田螺分別在50.00 mg N·L-1和200.00 mg N·L-1濃度下開始出現(xiàn)死亡，在100.00 mg N·L-1和800.00 mg N·L-1濃度下全部死亡。

96 h急性毒性正式試驗結果（表1）顯示，河蜆與中華圓田螺死亡率隨氨氮濃度的升高而增加，總氨氮濃度最高的實驗組均全部死亡。在相同試驗條件下（水溫T=19℃，pH=8.2）河蜆與中華圓田螺對氨氮的敏感性差異很大，兩者LC50相差近6倍。兩組擬合結果顯示，回歸直線對試驗實際觀測值線性擬合程度良好。

2.2 中、美水生生物對氨氮的敏感性

參照美國氨氮水生生物基準技術文件，搜集、篩選了氨氮對中美淡水生物的急性毒性和慢性毒性數(shù)據(jù)，并將所有毒性數(shù)據(jù)統(tǒng)一調(diào)整到標準水質(zhì)條件下（T=20℃，pH=7.0）。數(shù)據(jù)篩選結果見表2～表5。氨氮對我國淡水水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)主要包括：19個魚類數(shù)據(jù)，3個貝類數(shù)據(jù)，4個溞類數(shù)據(jù)和9個其他水生物種數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)來源已在表2中標出；氨氮對美國水生生物的急性毒性數(shù)據(jù)主要包括：46個魚類數(shù)據(jù)，22個貝類數(shù)據(jù)，9個溞類數(shù)據(jù)和22個其他水生物種數(shù)據(jù)（表3），數(shù)據(jù)來自2013年美國氨氮水生生物基準技術文件；氨氮對我國淡水水生生物的慢性毒性數(shù)據(jù)主要包括：1個魚類數(shù)據(jù)，2個溞類數(shù)據(jù)（表4）；氨氮對美國水生生物的慢性毒性數(shù)據(jù)主要包括：11個魚類數(shù)據(jù)，5個貝類數(shù)據(jù)，4個溞類數(shù)據(jù)和1個其他水生物種數(shù)據(jù)（表5），數(shù)據(jù)來自2013年美國氨氮水生生物基準技術文件。

表1 氨氮對本土貝類的96 h急性毒性實驗結果Table 1 Results of 96-h toxicity test for ammonia to local shellfish

由表2和表3中的數(shù)據(jù)可知，貝類作為最敏感的生物類群，在中美急性毒性的敏感性分布SMAV排序中均處在靠前的位置，魚類由于其物種間的差異，敏感性區(qū)別較大，如在表2中，中華鮭44.6 mg·L-1與黃鱔3475 mg·L-1的SMAV相差了兩個數(shù)量級，溞類在排序中處在靠后的位置，體現(xiàn)出了對氨氮的不敏感性。在中美慢性毒性的敏感性分布SMCV排序（表4和表5）中可以看出，不同物種對于氨氮的敏感性分布與中美SMAV排序一致，即貝類敏感性最強，溞類敏感性最弱，魚類適中。為了進一步比較物種對氨氮的敏感性差異，利用較為充足的急性數(shù)據(jù)繪制了中美物種比較SSD曲線圖，結果見圖1和圖2。

表2 氨氮對我國淡水生物的SMAV排序Table 2 Ranked SMAVs of ammonia to freshwater animals in China

由圖1和圖2可知，我國物種相比美國物種對氨氮的敏感性整體較弱。具體來說，我國魚類較美國魚類對氨氮的敏感性均體現(xiàn)出較弱的趨勢，中美溞類對氨氮的物種敏感性差異不明顯，魚、溞、貝3類物種對氨氮的物種敏感性排序為貝類＞魚類＞溞類。

2.3 氨氮水生生物水質(zhì)急性基準推算

依據(jù)我國水生生物水質(zhì)基準技術導則對表2和表3中的中美生物氨氮急性毒性數(shù)據(jù)進行分析計算，結果見表6和表7。導則指出決定系數(shù)R2越接近于1，均方根RMSE越接近于0，殘差平方和SSE越接近于0，K-S檢驗P值大于0.05，說明毒性數(shù)據(jù)的擬合優(yōu)度最大，模型擬合越精確，因此綜合4項參數(shù)，具有最優(yōu)擬合度的函數(shù)為邏輯斯蒂分布模型（Logistic），得出標準水質(zhì)條件下我國和美國的氨氮水質(zhì)基準閾值分別為0.84 mg·L-1和0.79 mg·L-1，結果接近。

表4 氨氮對我國淡水生物的SMCV排序Table 4 Ranked SMCVs of ammonia to freshwater animals in China

表5 氨氮對美國淡水生物的SMCV排序Table 5 Ranked SMCVs of ammonia to freshwater animals in America

3 討論

氨氮是我國流域水體中污染最嚴重的單項化合物，7大流域全部嚴重超標。在美國氨氮基準文件中，共評述了99種水生生物數(shù)據(jù)，貝類是所有水生生物中對氨氮最敏感的。當pH值小于7時，水中氨氮幾乎全部為離子氨（NH+4）形式，當pH值大于11時幾乎全部為非離子氨（NH3）形式，其中NH3能夠穿透脂質(zhì)性細胞膜，破壞水生動物的鰓組織并滲入血液，表現(xiàn)出很強的毒性效應，是威脅貝類生存的重要污染因子。

河蜆是廣泛分布在我國水域的淡水貝類，現(xiàn)有毒性數(shù)據(jù)顯示[28]，河蜆可能是我國淡水生物中對氨氮最敏感的生物，可以推測，長期高濃度的氨氮暴露可能對河蜆種群造成嚴重影響。中華圓田螺也是廣泛分布于我國各流域的典型貝類，本文選擇此兩種貝類開展了氨氮脅迫試驗。

圖1 中美淡水水生生物對氨氮的急性毒性物種敏感度分布比較Figure 1 Comparison of acute toxicity species sensitivity distribution of ammonia between aquatic organisms in China and America

圖2 中美魚類、溞類對氨氮的急性毒性物種敏感度分布比較Figure 2 Comparison of acute toxicity species sensitivity distribution of ammonia among fish，cladocera in China and America

表6 我國氨氮水生生物水質(zhì)急性基準推算結果Table 6 The results of acute baseline calculation of water quality of ammonia in China

表7 美國氨氮水生生物水質(zhì)急性基準推算結果Table 7 The results of acute baseline calculation of water quality of ammonia in America

實驗過程中發(fā)現(xiàn)在高濃度氨氮溶液的脅迫下，大部分河蜆會主動張開外套膜，日排泄物相比低濃度氨氮下產(chǎn)出較多，有研究[18]指出離子態(tài)氨在氨氮對水生脊椎生物（如魚類）的致毒效應中起到了不可忽視的作用。在神經(jīng)系統(tǒng)中，升高的會代替K+而使神經(jīng)元去極化，影響NMDA離子型谷氨酸受體的活性，進而導致中樞神經(jīng)系統(tǒng)中過量的Ca2+的涌入，最終導致神經(jīng)細胞死亡[32-34]，猜測在氨氮對無脊椎動物的致毒機理中NH+4可能發(fā)揮同樣的作用，但目前在無脊椎動物中是否存在NMDA受體未見報道，有待后續(xù)研究。Mummert等[35]推測可能是因為氨氮促使生物體代謝加快，增加了生物體對有毒物質(zhì)的吸收。溫度還可能通過對細胞膜的滲透性、內(nèi)源性氨的產(chǎn)生以及其他生理過程產(chǎn)生影響而改變氨氮的毒性[36-37]。

從圖1中SSD曲線的差異可知，我國物種相比美國物種整體上較不敏感，差異較為顯著。但從對水質(zhì)基準定值至關重要的HC5值來看，中美兩國非常接近，表明雖然我國淡水生物對氨氮的敏感性整體較弱，但氨氮水質(zhì)急性基準的定值應該和美國差異不大，對標準水質(zhì)條件下氨氮水質(zhì)急性基準閾值進行的具體計算結果也證實了這一點（中國為0.84 mg·L-1，美國為0.79 mg·L-1），因此在我國水質(zhì)基準研究尚不成熟的階段，可以適當借鑒美國氨氮基準用于我國水環(huán)境管理。前人研究[28]表明，中美氨氮水質(zhì)基準具有較明顯的差異，結論與本研究不同，造成這種差異的原因一是前人是依據(jù)美國水生生物基準技術導則，在生物屬的水平上對氨氮基準進行的計算，而本研究是依據(jù)我國發(fā)布的《淡水水生生物水質(zhì)基準制定技術指南》[20]，在物種的水平上對氨氮的SSD曲線進行擬合和計算，這會造成計算結果的不同。另外，該研究[28]搜集的物種包括了引進養(yǎng)殖物種，而本研究僅篩選了我國生態(tài)系統(tǒng)中廣泛分布的水生物種，物種選擇的差異也會造成計算結果的不同。需要說明的是，由于水質(zhì)條件會對氨氮的毒性和基準閾值的計算產(chǎn)生顯著影響[14]，因此對于水體特征差異明顯的水體，氨氮基準閾值的計算需要考慮水質(zhì)參數(shù)（溫度和pH值）的差異。

圖2展示了淡水物種對氨氮的敏感性分類比較的差異，在中美魚類對氨氮的敏感性比較中，各科魚類敏感性差別較大，以鮭科魚類最為敏感，鯉科次之[38]，前人也有相似報道[39-41]，這應該主要是因為鮭科魚類多為冷水性魚類，而我國魚類以鯉科為主，多為相對不敏感的暖水性魚類所致。另外，由圖2可知，我國溞類對氨氮的毒性數(shù)據(jù)較少，現(xiàn)有的若干數(shù)據(jù)散布在美國溞類SSD曲線的兩側，表明我國溞類與美國溞類對氨氮的物種敏感性基本一致，在全部物種的敏感性排序中，均在敏感性排序靠后的位置，對于氨氮的敏感性較強，與前人研究結果相近[42]。

對比中美貝類，發(fā)現(xiàn)絕大部分種類都不相同，我國貝類的氨氮毒性數(shù)據(jù)太少，后續(xù)隨我國淡水貝類氨氮毒性數(shù)據(jù)的積累，可以進行更全面的對比分析。王曉南等[38]在對中美淡水物種敏感性差異研究中提出，敏感性的不同主要由于地區(qū)差異及物種差異造成，此結論也適用于本研究。另外，對比實驗中所用受試貝類的規(guī)格不同，我國實驗所用貝類大多為貝類成體，實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)一調(diào)整至標準水質(zhì)下后，成體河蜆的LC50為299 mg N·L-1、成體中華圓田螺的LC50為2052 mg N·L-1，而美國實驗所用貝類均為幼體，由河蜆的氨氮毒性值可知成體與幼體差異很大，幼體對氨氮等外界毒素的敏感性更高[43]，隨貝類等生物的年齡和體型增大，對氨氮等污染物的耐受力增強[44]。鑒于我國貝類幼體對氨氮的毒性數(shù)據(jù)太少，生命階段差異不同，目前無法準確進行中美貝類敏感性差異比較。

由于我國與美國的慢性毒性數(shù)據(jù)均較少，不足以進行慢性毒性敏感性對比分析以及慢性基準值的計算，不過在我國與美國的SMCV排序（表4和表5）中發(fā)現(xiàn)，3類物種對氨氮慢性毒性的敏感性排序依然存在與急性毒性敏感度排序結果相同的趨勢，即貝類＞魚類＞溞類，這與前文所得出的結論如出一轍，后續(xù)將對實驗數(shù)據(jù)進行補充以驗證這一推測。

4 結論

（1）整體上我國淡水物種相比美國物種對氨氮的敏感性較弱，但計算結果表明，中美兩國在標準水質(zhì)條件下的氨氮水質(zhì)急性基準閾值接近（中國為0.84 mg·L-1，美國為0.79 mg·L-1），因此我國現(xiàn)階段可以適當借鑒美國氨氮水質(zhì)基準來進行水環(huán)境質(zhì)量評估與管理。

（2）在氨氮的物種急性毒性敏感性排序中，貝類的物種敏感性最高，其次是魚類，溞類敏感性最弱。我國魚類和貝類的敏感性相對美國較弱，而溞類差異不明顯。貝類幼體對氨氮的敏感性遠高于成體，建議在氨氮水質(zhì)基準研究中應使用貝類幼體進行毒性測試。