蔣旭瑤，吉喜燕，黃德英，張繼彪

（1.復旦大學環(huán)境科學與工程系，上海 200433；2.復旦大學化學系，上海 200433）

近年來，人工濕地由于其造價低、便于維修管理、處理效率高、觀賞性強等優(yōu)點，被廣泛應用于污水處理中[1-2]。然而，濕地在凈化水質的同時會釋放大量溫室氣體，越來越受到廣泛關注[3]。微生物和植物是人工濕地的重要組成部分，其污水處理能力取決于濕地設計、微生物群落和植物種類等[4]。微生物在濕地生物地球化學循環(huán)中起著重要作用；不同的微生物群落會產(chǎn)生不同的生物化學反應，導致營養(yǎng)鹽的消耗[5-6]。因此，濕地植物根系微生物群落結構的研究有助于改進人工濕地的設計以及管理，提高濕地水質凈化能力，并對濕地溫室氣體排放的控制提供理論依據(jù)[7]。濕地中微生物的硝化、反硝化作用是去除氮的主要途徑，硝化、反硝化細菌是反應的主要執(zhí)行者[8]。因此，對濕地中硝化細菌、反硝化細菌展開分析有助于濕地污水脫氮機制的研究。

過去，人們針對濕地微生物種群的研究一直建立在傳統(tǒng)的分離和培養(yǎng)方法上，這種方法費時費力，培養(yǎng)的種群數(shù)量也有限[9]。目前，關于濕地土壤微生物的研究大多運用傳統(tǒng)分子生物學技術，如PCR-DG?GE和FISH[10]。PCR-DGGE技術是將PCR擴增和變性梯度凝膠電泳結合起來，可對同一長度的PCR擴增片斷按序列的不同在變性梯度凝膠上分離，在分析微生物群落多樣性方面具有明顯的優(yōu)勢，但是它只適用于微生物比較豐富的樣本[10]。FISH技術是根據(jù)已知微生物不同分類級別上種群特異的DNA序列，以熒光標記的特異寡聚核苷酸片段作為探針，與環(huán)境基因組中DNA分子雜交，該技術可以進行樣品原位雜交，但受引物以及試樣不合適的限制[10]。高通量DNA測序是一種測序深度較深、覆蓋度較廣的方法，該技術通過大量平行序列產(chǎn)生大量DNA數(shù)據(jù)，其中的可操作性分類單元（OTUs）可用于有效分析樣本中微生物的多樣性[10]。

本研究選擇美人蕉、菖蒲和水蔥三種典型的濕地植物，通過構建復合垂直流人工濕地研究不同季節(jié)、上行池和下行池土壤根際微生物群落結構的變化特征，分析根系微生物結構和功能的對應關系，旨在為人工濕地的改進和優(yōu)化提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗系統(tǒng)

復合垂直流人工濕地系統(tǒng)位于復旦大學邯鄲校區(qū)研究基地，在自然光照下的露天大棚內(nèi)運行，示意圖如圖1所示。每個系統(tǒng)由上、下行池組成，尺寸為150 cm×90 cm×90 cm（長×寬×高），下行池內(nèi)基質自下而上分別為20 cm礫石（?30～50 mm）、20 cm礫石（? 10～20 mm）、20 cm細砂和10 cm土壤；上行池自下而上分別為20 cm礫石（?30～50 mm）、20 cm礫石（?10～20 mm）、10 cm細砂和10 cm土壤。每個系統(tǒng)種植一種植物，分別為菖蒲、美人蕉和水蔥，每平方米分別種植20棵、20棵和20簇。模擬生活污水從濕地下行池上端流入，從上行池上端流出。模擬生活污水主要是往自來水中加入葡萄糖、淀粉、魚粉蛋白胨、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂等。進水水質總有機碳、銨態(tài)氮、總氮和總磷的濃度分別為68～84、20～28、50～59 mg·L-1和4～6 mg·L-1。進水采用間歇流的方式，一周配一次1000 L污水，污水放置在一個1000 L的塑料桶中，水力負荷為330 mm·d-1，停留時間為5 d。系統(tǒng)從2015年6月開始運行，到2017年5月份結束，運行穩(wěn)定，植物長勢良好。

圖1 復合垂直流人工濕地系統(tǒng)示意圖Figure 1 Picture of integrated vertical flow constructed wetland

1.2 樣品采集

本試驗于2016年7月、10月和2017年1月用五點采樣法分別采集三種植物濕地系統(tǒng)的上行池、下行池10 cm處根系土壤。樣品標記為：ACL表示菖蒲，CIL表示美人蕉，SVV表示水蔥；7、10、1表示月份；D表示下行池，U表示上行池。樣品名稱分別為：ACL7D、ACL7U、CIL7D、CIL7U、SVV7D、SVV7U、ACL10D、 ACL10U、 CIL10D、 CIL10U、 SVV10D、SVV10U、ACL1D、ACL1U、CIL1D、CIL1U、SVV1D、SVV1U。

1.3 DNA提取

采用Omega E.Z.N.A.?Soil DNA Kit提取試劑盒提取根系土壤DNA，按說明書完成相關操作，然后將提取好的DNA保存在-20℃。

1.4 PCR擴增與測序

本實驗采用引物520F（5′-barcode+GCACCTA?AYTGGGYDTAAAGNG-3′）和 802R（5′-TACNVGGGTATCTAATCC-3′）[11]，擴增長度約為 280 bp的 16S rRNA V4區(qū)用來測序。

PCR采用NEB Q5 DNA高保真聚合酶，各組成及用量如下：0.25 μLQ5 high-fidelity DNA polymerase，5 μL 5*Reaction Buffer，5 μL 5*High GC Buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol·L-1），1 μL模板 DNA，1 μL 正向引物（10 μmol·L-1），1 μL反向引物（10 μmol·L-1）和11.25 μL水。PCR擴增程序如下：將PCR反應所需的成分配制完后，在PCR儀上于98℃預變性30 s，使模板DNA充分變性，然后進入擴增循環(huán)。在每一個循環(huán)中，先于98℃保持15 s使模板變性，然后將溫度降到50℃，保持30 s，使引物與模板充分退火；在72℃保持30 s，使引物在模板上延伸，合成DNA，完成一個循環(huán)。重復這樣的循環(huán)25～27次，使擴增的DNA片段大量累積。最后，在72℃保持5 min，使產(chǎn)物延伸完整，4℃保存。

利用Illumina公司的TruSeq Nano DNA LT Li?brary Prep Kit進行建庫；在MiSeq機器上進行MiSeq Reagent Kit V3（600 cycles）2×300 bp的雙端測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

對樣品進行Alpha多樣性分析時，在90%的最低測序深度水平，采取對OTU豐度矩陣中全體樣本進行隨機重復抽樣，并使用Chao1指數(shù)來表示群落豐富度。樣品進行Beta多樣性分析時，對Unweighted Uni?Frac距離矩陣和Weighted UniFrac距離矩陣進行NMDS分析，用于描述群落樣本的結構分布。

2 結果與討論

圖2 樣品的稀疏曲線Figure 2 The rarefaction curves for samples

樣品的稀疏曲線如圖2所示，所有樣品測序量在5260時，曲線已趨于平緩或者達到平臺期，因此可以認為測序深度已經(jīng)基本覆蓋到樣品中所有的物種。

三種植物濕地微生物多樣性指數(shù)如圖3所示。水蔥濕地在實驗期間，上行池與下行池的物種豐富度差異不大。除10月份美人蕉濕地下行池Chao1指數(shù)小于上行池Chao1指數(shù)外，菖蒲濕地與美人蕉濕地表現(xiàn)為其下行池的豐富度大于上行池。這是因為下行池為污水輸入端，營養(yǎng)鹽含量較高，適宜微生物代謝繁殖。流入上行池的污水經(jīng)過下行池的降解處理，能被微生物利用的營養(yǎng)鹽降低，導致微生物豐富度下降。

圖3 三種植物濕地微生物多樣性指數(shù)Figure 3 Diversity indices of microbes in three plant wetlands

本研究用NMDS分析（Nonmetric Multidimension?al Scaling），通過降維處理簡化數(shù)據(jù)結構，在特定距離尺度下描述樣本分布特征。圖4a為Unweighted Uni?Frac NMDS分析的樣本二維排序圖。除ACL7U樣品，樣本組均勻分布在坐標上下兩側，表明在試驗期間上行池和下行池樣本組群落成員相似，但是兩者群落成員組成之間有差異，存在各自獨有的微生物。這可能是因為下行池消耗了大量氧氣，導致上行池氧氣較低，使得下行池中有氧細菌遠多于上行池中有氧細菌數(shù)[12]。

由圖4b可知，除ACL7U樣品，上行池樣品組靠的較近，表明從群落成員豐度上來看，上行池樣本相似性較下行池樣本相似性高，這主要是因為下行池是污水凈化的主要場所，下行池的營養(yǎng)鹽含量和溶解氧含量等相關影響因素沿程變化梯度較大，造成微生物生存環(huán)境變化較大，三種植物濕地在不同環(huán)境影響下形成了差異略大的生態(tài)系統(tǒng)。而經(jīng)過下行池的水流，其中的污染物濃度已經(jīng)較低，其濃度、溶解氧等變化較為平緩，導致微生物所處環(huán)境較為相似[13]，因此上行池樣品組相似性高于下行池。

圖4 Unweighted UniFrac NMDS分析的樣本二維排序圖（a）和Weighted UniFrac NMDS分析的樣本二維排序圖（b）Figure 4 Unweighted UniFrac NMDS analysis of samples in two dimensions（a）and Weighted UniFrac NMDS analysis of samples in two dimensions（b）

門和屬水平上微生物群落組成及豐度如圖5所示，在菖蒲濕地中（圖5左側a），主要的微生物有變形菌門（Proteobacteria，38.4%）、酸桿菌門（Acidobacteria，16.9%）、綠彎菌門（Chloroflexi，13.1%）。變形菌門所占比例較大，這與已有研究一致[14-15]。酸桿菌門相對豐度在菖蒲濕地下行池夏秋冬季節(jié)、上行池夏秋冬季節(jié)占有較大比例，分別為15.6%、15.8%、17.0%、17.2%、16.5%、19.5%。綠彎菌門的相對豐度在菖蒲下行池夏秋冬季節(jié)、上行池夏秋冬季節(jié)分別占14.5%、11.7%、11.2%、11.0%、16.5%、13.8%。

美人蕉濕地的微生物群落結果如圖5左側b所示，下行池根系的變形菌門相對豐度在秋季最大，達到50.9%；上行池根系變形菌門相對豐度在夏季、秋季和冬季差異不大，維持在33.0%到34.2%之間?？傮w來說，下行池變形菌門相對豐度高于上行池。酸桿菌門在下行池、上行池的相對豐度夏季最高，分別為20.4%、18.7%，且下行池酸桿菌門相對豐度高于上行池。綠彎菌門下行池夏季較高，達到14.4%，上行池秋季較高，達到16.6%。

水蔥濕地根系微生物主要類別同為變形菌門（34.6%）、酸桿菌門（17.5%）、綠彎菌門（10.8%）（圖5左側c）。隨季節(jié)演替，變形菌門在下行池的相對豐度從46.3%降到31.1%。上行池相對豐度隨季節(jié)變化不明顯，基本維持在30.0%。下行池酸桿菌門的相對豐度夏季＞秋季＞冬季，分別為17.0%、16.1%、10.7%，上行池秋季＞夏季＞冬季，分別為21.7%、20.0%、19.6%。綠彎菌門下行池秋季＞夏季＞冬季，分別為13.0%、9.4%、6.8%。

三種濕地植物根系微生物組成在門水平上相似，主要有變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等。變形菌門比例較高，包含許多微生物都與碳、氮、硫循環(huán)相關[16]，在去除碳、氮方面有重要的作用，同時對溫室氣體的生成有巨大影響。酸桿菌門是嚴格厭氧細菌，用來發(fā)酵芳香族混合物和醋酸鹽[17]。綠彎菌門在營養(yǎng)鹽的去除過程中發(fā)揮著重要作用[18]。同時濕地中還檢測到了浮霉菌門（Planctomycetes）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、放線菌門（Actinobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、泉古菌門（Crenarchaeota）、厚壁菌門（Firmicutes）等。浮霉菌門能將NO-2作為電子受體，將氨轉化為氮氣，對NH3-N的去除有重要影響[19]。芽單胞菌門中的一些菌種已被確認為革蘭氏陰性、好氧、積累磷酸鹽微生物[20]。放線菌門將氫氣作為電子供體用來去除硝酸鹽，對生成N2O有重要影響。疣微菌門相對豐度為0.8%，能氧化CH4，對其排放有抑制作用[21]。

圖5 門和屬水平上微生物群落在樣本中組成及豐度Figure 5 Taxonomic composition at phylum and genus level and abundance of microbes in each sample

屬水平上的微生物群落組成及相對豐度如圖5右側圖所示，三種濕地根系中主要的微生物屬有Ni?trospira、Candidatus Nitrosophaera等。其中，Nitrospira是硝化細菌；Candidatus Nitrosophaera是亞硝化細菌。不同植物濕地優(yōu)勢菌屬有類似，也有差異。硝化細菌最主要的微生物屬為Nitrospira，下行池在秋季達到最高，相對豐度為2.44%。

菖蒲濕地在屬水平上的硝化、反硝化細菌組成及其相對豐度如表1所示。Nitrospira和Candidatus Ni?trosophaera是主要的硝化細菌，下行池、上行池相對豐度均在秋季達到最高，分別為6.64%、4.33%。反硝化微生物有Dechloromonas、Flavobacterium、Pseudomo?nas屬等，這與已有研究結果一致[22-25]。菖蒲下行池的根系反硝化微生物在夏季所占比例最多，約1.34%，秋季與冬季差異不明顯，上行池反硝化細菌相對豐度隨季節(jié)變化不明顯，基本維持在0.62%～0.78%。下行池反硝化微生物相對豐度高于上行池。下行池硝化細菌、反硝化細菌相對豐度都比上行池高，這可能是因為下行池是進水端，含有豐富的氮源、碳源供微生物生長活動[13]。

在美人蕉濕地中，下行池植物根系的硝化細菌Nitrospira和Candidatus Nitrosophaera相對豐度在夏季達到最高3.60%，上行池秋季達到最高3.62%（表2）。反硝化細菌主要有Dechloromonas、Flavobacterium、Pseudomonas等。下行池和上行池根系反硝化細菌相對豐度分別在秋季和夏季達到最高，分別為2.30%和0.98%。

表1 菖蒲濕地硝化細菌、反硝化細菌的相對豐度表（%）Table 1 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in ACL cell（%）

表2 美人蕉濕地硝化細菌、反硝化細菌的相對豐度表（%）Table 2 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in CIL cell（%）

在水蔥濕地中，硝化細菌為Nitrospira和Candida?tus Nitrosophaera（表3），上、下行池的相對豐度在秋季達到最高，分別占4.16%、4.78%。反硝化細菌有De?chloromonas、Flavobacterium、Pseudomonas等，下行池反硝化細菌相對豐度在秋季達到最高，為1.51%；上行池冬季達到最高，為1.55%。

總之，濕地植物根系硝化細菌屬為Nitrospira、Candidatus Nitrosophaera，反硝化細菌屬為Dechlo?romonas、Flavobacterium、Pseudomonas等。菖蒲和水蔥濕地秋季硝化細菌豐度均高于夏季和冬季。

3 結論

（1）菖蒲濕地、美人蕉濕地和水蔥濕地系統(tǒng)Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為秋季＞夏季＞冬季，即微生物豐富度秋季＞夏季＞冬季。水蔥濕地上行池與下行池物種豐富度差異不大；除秋季的美人蕉濕地，菖蒲濕地與美人蕉濕地Chao1指數(shù)表現(xiàn)為下行池＞上行池。

（2）在試驗期間，各濕地上行池和下行池樣本組群落組成均相似；但上、下行池群落成員組成之間有差異，上行池樣本相似性較下行池樣本高。

（3）門水平上，濕地根系微生物從大到小依次為變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門等。從屬水平上，檢測到了硝化細菌Nitrospira和Candidatus Nitrosophaera；反硝化細菌Dechloromonas、Flavobacterium和Pseudo?monas等。菖蒲濕地和水蔥濕地根系硝化細菌秋季的相對豐度均高于夏季和冬季。

表3 水蔥濕地硝化細菌、反硝化細菌的相對豐度表（%）Table 3 The relative abundance of nitrifying bacteria and denitrifying bacteria in SVV cell（%）