張紅晨 顧錫冬 謝小紅

乳腺癌發(fā)病率居女性癌癥的首位，且發(fā)病人群有年輕化趨勢[1]。手術(shù)、放療、化療、內(nèi)分泌治療及靶向治療是乳腺癌的主要治療方式，若復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移或產(chǎn)生耐藥，患者預(yù)后往往較差[2]。微小RNA（miRNA）是一類長度約22nt的非編碼單鏈RNA小分子，通過在轉(zhuǎn)錄或轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)其靶基因的表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，進(jìn)而參與細(xì)胞分化、增殖和凋亡[3]。相關(guān)文獻(xiàn)表明，miRNA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展及變異過程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用[4]。本研究對(duì)miRNA-1271在乳腺癌組織中的表達(dá)以及對(duì)人乳腺癌細(xì)胞增殖的影響作一探討，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 材料 人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院；SPF級(jí)健康雌性裸鼠（4～6周）購于中國科學(xué)院上海實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，體重（20.0±3.0）g。改良杜氏伊格爾（DMEM）培養(yǎng)基購于美國Gibico公司；FBS購自杭州四季青生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染過程中使用的LipofectamineTM2000試劑盒及Trizol試劑均購自美國Invitrogen公司；miRNA檢測試劑盒購于德國Qiagen公司；凋亡檢測試劑盒及結(jié)晶紫染液均購于美國Sigma公司。CCK-8試劑盒購于美國BD Biosciences公司。80例乳腺癌組織及其癌旁正常組織標(biāo)本來源于本院2017年1月至2018年1月經(jīng)術(shù)后病理學(xué)證實(shí)的原發(fā)性乳腺癌患者，所有患者術(shù)前未接受過放化療，年齡 28～75（39，66）歲，均簽署知情同意書。

1.2 RT-PCR法檢測乳腺癌組織及癌旁正常組織miRNA-1271表達(dá) 將乳腺癌及癌旁正常組織標(biāo)本制備成勻漿，離心除去碎片物質(zhì)，取上清液，加入裂解液1ml，依次用氯仿、異丙醇抽提，乙醇洗滌，通過紫外分光光度計(jì)檢測樣品中RNA濃度。miRNA-1271引物為5′-CUUGGCACCUAGCAAGCACUCA-3′。 以 95℃ 5min、95℃ 15s、60℃ 30s、72℃ 30s共 40 個(gè)循環(huán)進(jìn)行 RT-PCR檢測。miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，利用TaqMan miRNA檢測并量化miRNA-1271在乳腺癌及癌旁正常組織中的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 將人乳腺癌細(xì)胞株MCF-7和MDA-MB-231分別置于添加10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，在37℃恒溫、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在細(xì)胞對(duì)數(shù)生長期，使用乙二胺四乙酸消化。為研究miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞增殖能力的影響，筆者對(duì)MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染，以增加miRNA-1271的表達(dá)。轉(zhuǎn)染前取培養(yǎng)好的細(xì)胞接種于6孔培養(yǎng)板，轉(zhuǎn)染時(shí)將培養(yǎng)液更換為無血清無雙抗的培養(yǎng)液，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，將miRNA-1271模擬物或陰性對(duì)照（空載質(zhì)粒）與脂質(zhì)體試劑混勻，室溫靜置20min，轉(zhuǎn)染后6～8h，更換為正常的完全培養(yǎng)基。RT-PCR法檢測實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組miRNA-1271相對(duì)表達(dá)量。轉(zhuǎn)染miRNA-1271模擬物質(zhì)粒的乳腺癌細(xì)胞為實(shí)驗(yàn)組；轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的乳腺癌細(xì)胞為對(duì)照組。

1.4 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響 采用CCK-8實(shí)驗(yàn)。收集穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后的MCF-7和MDAMB-231細(xì)胞，分別制成單細(xì)胞懸液并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。在96孔培養(yǎng)板中每孔接種細(xì)胞1×103個(gè)，每孔加入培養(yǎng)液100μl，復(fù)孔數(shù)設(shè)置為6個(gè)。連續(xù)4d在固定時(shí)間點(diǎn)每孔加入CCK-8試劑10μl，搖勻后避光培養(yǎng)3h。利用多功能酶標(biāo)儀檢測（波長490nm處）測定吸光度（OD）值，并繪制細(xì)胞生長曲線。

1.5 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成的影響 采用集落形成實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后鋪于6孔板中，細(xì)胞密度為300個(gè)/孔。每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔，反復(fù)吹打并搖勻，防止細(xì)胞成團(tuán)。培養(yǎng)2周后，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下計(jì)數(shù)并分析集落形成數(shù)。

1.6 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 采用流式細(xì)胞術(shù)。取穩(wěn)定轉(zhuǎn)染24h后實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組乳腺癌細(xì)胞，冰PBS洗滌，冰乙醇固定細(xì)胞，4℃過夜。離心5min后收集細(xì)胞，加入5μl異硫氰酸熒光素并輕輕混勻，3min后再加入10μl碘化丙啶，37℃水箱中避光反應(yīng)15min；離心后重懸于0.5ml預(yù)冷的緩沖液中，混勻后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡情況。

1.7 miRNA-1271對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響 采用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。取實(shí)驗(yàn)組（穩(wěn)定過表達(dá)miRNA-1271）和對(duì)照組MCF-7細(xì)胞，分別配置成1×107個(gè)/ml細(xì)胞懸液，接種于裸鼠右腋皮下。在無病原體環(huán)境下飼養(yǎng)裸鼠。細(xì)胞接種4周后，處死小鼠，取出移植瘤組織并稱重。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS 19.0和GraphPad Prism 5.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料用 表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌組織與癌旁正常組織中miRNA-1271相對(duì)表達(dá)量比較 乳腺癌組織中miRNA-1271相對(duì)表達(dá)量為0.55±0.02，明顯低于癌旁正常組織中的1.50±0.03，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1。

圖1 乳腺癌組織與癌旁正常組織中miRNA-1271相對(duì)表達(dá)量比較（*P＜0.05）

2.2 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組MCF-7和MDA-MB-231細(xì)胞中miRNA-1271相對(duì)表達(dá)量均明顯升高（均P＜0.05），即轉(zhuǎn)染成功，見圖2。與對(duì)照組比較，上調(diào)miRNA-1271表達(dá)后的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞OD值明顯低于對(duì)照組（均P＜0.05），見圖3。這表明上調(diào)miRNA-1271表達(dá)后，MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的體外增殖能力受到明顯抑制。

2.3 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成的影響 與對(duì)照組比較，miRNA-1271過表達(dá)后的 MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞形成克隆體積更小、數(shù)目更少，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組集落形成數(shù)比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），見圖4。這表明miRNA-1271能抑制MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞的克隆形成能力。

圖2 乳腺癌細(xì)胞中miRNA-1271的轉(zhuǎn)染效率（a：MCF-7細(xì)胞；b：MDA-MB-231細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

圖3 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞體外增殖的影響（a：MCF-7細(xì)胞；b：MDA-MB-231細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.4 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響 與對(duì)照組比較，轉(zhuǎn)染miRNA-1271的MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞凋亡率明顯升高（均P＜0.05），見圖5。這表明miRNA-1271能促進(jìn)MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞凋亡。

圖4 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞克隆形成的影響（a：MCF-7細(xì)胞；b：MDA-MB-231細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

圖5 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響（a：MCF-7細(xì)胞；b：MDA-MB-231細(xì)胞；與對(duì)照組比較，*P＜0.05）

2.5 miRNA-1271對(duì)MCF-7乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響 與對(duì)照組比較，實(shí)驗(yàn)組裸鼠移植瘤體積明顯較小，質(zhì)量明顯較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖6。這表明上調(diào)miRNA-1271表達(dá)后，MCF-7乳腺癌細(xì)胞的體內(nèi)增殖能力受到明顯抑制。

圖6 miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞體內(nèi)增殖的影響（a：兩組移植瘤體積比較；b：兩組移植瘤質(zhì)量比較，*P＜0.05）

3 討論

在女性惡性腫瘤中，乳腺癌發(fā)病率及病死率均居首位，嚴(yán)重威脅著女性健康[5]。miRNA是一組進(jìn)化保守且具有調(diào)控功能的非編碼RNA，通過與靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)互補(bǔ)配對(duì)結(jié)合，導(dǎo)致miRNA降解或抑制其翻譯表達(dá)[6]。許多miRNA發(fā)揮著類似于癌基因或抑癌基因的作用，是腫瘤的潛在治療靶點(diǎn)和預(yù)后指標(biāo)[7]。miRNA-1271是在人類胚胎干細(xì)胞中的ARL10基因第2內(nèi)含子區(qū)域被識(shí)別，是miRNA-96的同源類似物[8]。最近研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271 在肝癌[9]、肺癌[10]、結(jié)腸癌[11]、前列腺癌[12]和胃癌[13]中均呈低表達(dá)。在肺癌中，miRNA-1271表達(dá)降低；外源性上調(diào)其表達(dá)后，miRNA-1271通過調(diào)控mTOR基因可抑制癌細(xì)胞的增殖[10]。在胃癌中，miRNA-1271因甲基化而表達(dá)降低，通過靶向調(diào)控MEK1/ERK/MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在胃癌細(xì)胞生長、侵襲和遷移過程中發(fā)揮著重要作用[13]。然而，miRNA-1271在乳腺癌中的研究報(bào)道尚少，其生物學(xué)功能尚待闡明。

本研究對(duì)80例乳腺癌及癌旁正常組織中miRNA-1271表達(dá)進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-1271在乳腺癌組織中呈低表達(dá)，說明miRNA-1271可能在乳腺癌中發(fā)揮抑癌基因的作用。于是，筆者對(duì)MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞穩(wěn)定轉(zhuǎn)染miRNA-1271模擬物，以探究上調(diào)miRNA-1271對(duì)乳腺癌細(xì)胞生物學(xué)功能的影響。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271的表達(dá)水平升高后，乳腺癌細(xì)胞的體外增殖能力受到明顯抑制；集落形成實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271能明顯減弱腫瘤細(xì)胞的成瘤能力。裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，miRNA-1271在體內(nèi)亦能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖。細(xì)胞凋亡，即細(xì)胞的程序性死亡，是由基因控制的細(xì)胞自主的有序的死亡[14]。凋亡是多基因多步驟嚴(yán)格控制的過程，而凋亡調(diào)控的失衡是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的重要過程。本實(shí)驗(yàn)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-1271能通過促進(jìn)凋亡的發(fā)生來抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖能力。Qin等[15]實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之相似，在肝癌中低表達(dá)的miRNA-1271，通過靶向作用于FOXQ1基因，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡比例增加，從而抑制肝癌細(xì)胞的增殖。關(guān)于乳腺癌的研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXQ1是TGF-β信號(hào)通路中的一個(gè)重要靶點(diǎn)，miRNA-1271促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制可能與FOXQ1相關(guān)[16]。Du等[17]近期研究發(fā)現(xiàn)，miRNA-1271在乳腺癌組織及細(xì)胞中的表達(dá)明顯降低，并通過靶向調(diào)控SPIN1基因表達(dá)來抑制乳腺癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移能力，呈現(xiàn)出抑癌基因的活性。

綜上所述，miRNA-1271在乳腺癌組織中低表達(dá)；上調(diào)miRNA-1271表達(dá)，能抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)凋亡的發(fā)生，具有抑癌作用。本研究為乳腺癌的治療提供了一個(gè)新思路，為后續(xù)深入探討miRNA-1271在乳腺癌中的作用機(jī)制提供了前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。