劉志文，馮慧芳，夏麗偉，吳又明，林曉嵐

隨著近年來健康體檢的推廣及普及、宮頸癌的早期診斷率得到了較大提高，臨床分期≤Ⅱa期的宮頸癌預后較好。在臨床分期≤Ⅱa期的宮頸癌中，Ⅰb2和Ⅱa2屬于局部晚期腫瘤，相比Ⅰb1期和Ⅱa1期80%以上的5年生存率，局部晚期宮頸癌手術切除后的復發(fā)率和轉移率較高[1]。宮頸癌細胞增殖和侵襲所造成的癌細胞局部浸潤是導致手術切除后微病灶殘留的重要因素，也直接增加了術后轉移及復發(fā)的風險。新輔助化療是針對中晚期惡性腫瘤提出的治療策略，通過術前全身或局部應用化療藥物來殺傷腫瘤細胞、降低腫瘤分期，進而為手術切除病灶創(chuàng)造有利條件。近年來，也有研究報道了新輔助化療用于局部晚期宮頸癌的價值，在手術切除的基礎上使用新輔助化療能夠有效延長患者的無瘤生存時間[2]，但關于新輔助化療對局部晚期宮頸癌病灶內癌細胞惡性生物學特征的影響尚未明確。在本研究中，筆者具體分析了術前新輔助化療對局部晚期宮頸癌患者手術切除病灶內惡性分子表達的影響，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2015年3月—2017年6月期間在南方醫(yī)科大學附屬小欖醫(yī)院婦產科診斷為Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌的患者作為研究對象，所有患者均經病理學活檢診斷為宮頸鱗癌，結合影像學檢查判斷FIGO分期為Ⅰb2和Ⅱa2期；排除既往有其他惡性腫瘤病史、入組前接受過放化療的患者。共納入118例患者，采用隨機數(shù)字表法分為試驗組和對照組，每組各59例。試驗組在接受新輔助化療后進行手術切除，年齡39～49(42.8±5.2)歲；Ⅰb2期32例，Ⅱa2期27例；病灶直徑2.7～5.5( 4.2±0.6)cm。對照組患者直接進行手術切除，年齡37～47(43.2±5.5)歲；Ⅰb2期34例，Ⅱa2期25例；病灶直徑2.5～5.3(4.5±0.7)cm。2組患者一般資料比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經醫(yī)院倫理委員會審查批準，患者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 治療方法 試驗組患者按照紫杉醇+順鉑的方案進行新輔助化療，化療前6 h和12 h均給予地塞米松10 mg肌肉注射，而后給予紫杉醇175 mg/m2，d 1，靜脈滴注，順鉑100 mg/m2，d 1～3，靜脈滴注，21 d為1個周期，共進行2個周期?；熃Y束后2～3周，復查肝腎功能排除手術禁忌證后進行手術切除治療。對照組患者不行新輔助化療，直接進行手術切除治療。

1.3 病灶惡性分子表達量的測定 取2組患者手術切除的腫瘤病灶適量送深圳華大基因科技有限公司，采用RNA提取試劑盒分離病灶內RNA，采用cDNA合成試劑盒將RNA樣本反轉錄為cDNA，最后用PCR試劑盒配置反應體系：cDNA 2 μl、反應混合液10 μl、引物混合液0.8 μl、去離子水7.2 μl。將配置好的反應體系放置在PCR儀上進行反應，得到反應曲線后自動生成循環(huán)閾值(Ct)，根據(jù)公式2-ΔΔCt計算促增殖分子[Ki-67、人細胞周期相關激酶(CCRK)、細胞周期蛋白B1(CyclinD1)、細胞周期蛋白依賴性激酶1(CDK1)、Polo樣激酶1(Plk1)、生成素(Survivin)]、抑癌基因[多亮氨酸重復區(qū)免疫球蛋白樣蛋白1(LRIG1)、p16基因、真核起始因子4E3(eIF4E3)、N-myc下游調節(jié)基因4(NDRG4)、Ras相關結構域因子2A(RASSF2A)、增強子結合蛋白1(Ebp1)]及侵襲基因[β-連環(huán)蛋白(β-catenin)、基質金屬蛋白酶-8(MMP-8)、解聚素—金屬蛋白酶19(ADAM19)、金屬蛋白酶組織抑制劑1(TIMP1)、E-鈣黏蛋白(E-cadherin)]的表達量。

2 結 果

2.1 促增殖分子表達量的比較 結果顯示，試驗組患者的宮頸癌病灶內Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin的mRNA表達量顯著低于對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表1。

2.2 抑癌基因表達量的比較 結果顯示，試驗組患者的宮頸癌病灶內LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1的mRNA表達量顯著高于對照組，2組間比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表2。

2.3 侵襲基因表達量的比較 結果顯示，試驗組患者的宮頸癌病灶內β-catenin、MMP-8、ADAM19的mRNA表達量顯著低于對照組，TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量顯著高于對照組，2組間比較差有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見表3。

表1 2組宮頸癌病灶內Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin表達量的比較

表2 2組宮頸癌病灶內LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1表達量的比較

表3 2組宮頸癌病灶內β-catenin、MMP-8、ADAM19、TIMP1、E-cadherin表達量的比較

3 討 論

Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌被定義為局部晚期宮頸癌，Ⅰb2期是指腫瘤病灶局限于宮頸且病灶最大直徑超過4 cm，Ⅱa2期是指腫瘤病灶超出子宮頸并累及陰道、但未達到陰道下1/3且無宮旁浸潤。相比Ⅰb1及Ⅱa1宮頸癌，Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌病灶內癌細胞的增殖和侵襲能力較強，存在較為顯著的局部微浸潤，手術切除后容易殘留微病灶并增加局部復發(fā)及遠處轉移的風險，Ⅰb2和Ⅱa2期宮頸癌的預后也相對較差。近年來，新輔助化療被越來越多地用于惡性腫瘤的輔助治療，術前通過全身或局部使用化療藥物來殺傷癌細胞，進而能夠縮小腫瘤體積及微浸潤范圍，同時也能在一定程度上減輕盆腔充血程度、松動腫瘤鄰近的宮旁組織，有利于手術對病灶的徹底切除[3-4]。已有研究報道，新輔助化療用于局部晚期宮頸癌能夠提高總生存率、延長無瘤生存時間[5]，但關于新輔助化療對局部晚期宮頸癌病灶內增殖、侵襲等惡性生物學行為的影響尚未明確。

宮頸癌病灶的生長與病灶內癌細胞活躍的增殖密切相關，而癌細胞的增殖又受到了多種促增殖分子的調控。Ki-67是細胞核內與細胞增殖活力直接相關的抗原，參與了細胞增殖過程中DNA復制的調控[6]。CCRK是參與細胞周期正性調控的上游分子，能夠催化下游信號分子的磷酸化并增加多種細胞周期蛋白的活化。CyclinB1及其激酶CDK1受到細胞周期相關激酶(CCRK)的調控，在CCRK作用下發(fā)生活化的CyclinB1及CDK1能夠形成復合體，進而加速細胞周期通過G2/M檢查點并進入有絲分裂階段，有助于促進細胞增殖[7]。Plk1是新發(fā)現(xiàn)的一類絲氨酸/蘇氨酸激酶，同樣能夠促進CyclinB1/CDK1復合體的形成，進而加速細胞周期、促進細胞增殖。Survivin是抗凋亡蛋白家族中活性最強的成員，能夠與凋亡級聯(lián)激活通路中的多種Caspase分子結合并拮抗其活性，進而阻礙細胞凋亡過程的進展并為細胞增殖創(chuàng)造有利條件[8]。筆者通過分析宮頸癌病灶內以上促增殖分子表達量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗組患者的宮頸癌病灶內Ki-67、CCRK、CyclinB1、CDK1、Plk1、Survivin的mRNA表達量顯著降低。這就說明新輔助化療能夠減少局部晚期宮頸癌病灶內多種促增殖分子的表達，進而抑制癌細胞的增殖。

宮頸癌病灶內癌細胞的增殖不僅與促增殖分子表達的上調有關，同時還與多種具有促凋亡及增殖抑制效應的抑癌基因的低表達或表達缺失有關。LRIG1是新發(fā)現(xiàn)的宮頸癌相關抑癌基因，其編碼產物是一類跨膜蛋白，能夠對多種生長因子所介導的細胞生長效應產生抑制作用，進而誘導細胞發(fā)生凋亡[9]。p16又稱為MTS1，在細胞周期中能夠使多種細胞周期蛋白相關激酶的活性發(fā)生抑制，進而限制細胞周期的發(fā)展并誘導細胞發(fā)生凋亡[10-11]。eIF4E3是一類真核細胞內的翻譯起始因子，具有潛在的抑癌活性，主要通過阻礙細胞周期來產生抑癌作用[12-13]。NDRG4是N-myc調控通路的下游分子，能夠對PI3K/AKT通路的激活產生抑制作用，進而減弱由該通路所介導的細胞增殖。RASSF2A是RAS信號轉導過程中的負性調控分子，具有RAS相關結構域，能夠阻礙RAS所介導的增殖效應并促進細胞發(fā)生凋亡[14]。Ebp1是一類ErbB-3胞內結合蛋白，在外界理化因素的刺激下會與ErbB-3分離并向細胞核內移位，進而對細胞的增殖產生抑制作用[15-16]。筆者通過分析宮頸癌病灶內以上抑癌基因表達量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗組患者的宮頸癌病灶內LRIG1、p16、eIF4E3、NDRG4、RASSF2A、Ebp1的mRNA表達量顯著降低。這就說明新輔助化療能夠增加局部晚期宮頸癌病灶內多種抑癌基因的表達，進而促進癌細胞的凋亡。

宮頸癌細胞在增殖的基礎上向鄰近組織及脈管系統(tǒng)的侵襲是造成腫瘤局部浸潤及遠處轉移的重要生物學行為，多種侵襲調控分子與之密切相關。Wnt通路是細胞內調控蛋白酶表達、影響細胞侵襲活力的重要信號通路，在Wnt通路處于靜息狀態(tài)時，下游分子Frizzled蛋白、GSK-3β以及β-catenin形成復合體并對β-catenin產生水解作用；當Wnt通路發(fā)生激活時，β-catenin復合體解離、其受到的水解作用也相應減弱，進而造成β-catenin在細胞內聚集并不斷向細胞核內轉位[17-18]。在β-catenin進入細胞核后，能夠啟動MMP-8、ADAM19等多種蛋白酶的表達。MMP-8是重要的基質金屬蛋白酶，而ADAM19則兼具解聚素及金屬蛋白酶活性，兩者對細胞外基質內的多種成分具有水解作用，進而能夠促進細胞突破細胞外基質的限制并呈浸潤性生成的態(tài)勢。TIMP1是蛋白酶活性的直接抑制分子，能夠使蛋白酶的水解活性減弱并抑制細胞的侵襲；E-cadherin則是上皮細胞的標志分子，有助于細胞間形成緊密連接并阻礙細胞的運動及侵襲[19-20]。筆者通過分析宮頸癌病灶內以上侵襲基因表達量的改變發(fā)現(xiàn)：與對照組比較，試驗組宮頸癌病灶內β-catenin、MMP-8、ADAM19的mRNA表達量顯著降低，TIMP1、E-cadherin的mRNA表達量顯著升高。這就說明新輔助化療能夠調節(jié)局部晚期宮頸癌病灶內多種侵襲基因的表達，減少促侵襲基因表達、增殖侵襲抑制基因表達并阻礙癌細胞的侵襲過程。

綜上所述，術前新輔助化療能夠抑制宮頸癌病灶內促增殖分子及促侵襲基因的表達，促進抑癌基因及侵襲抑制基因的表達，具有積極的臨床應用價值。

利益沖突：無

作者貢獻聲明

劉志文、馮慧芳：研究方案設計，論文撰寫，實施研究；夏麗偉：論文審核；吳又明、林曉嵐：統(tǒng)計學分析