張濤，周曉晴，杜宗漢，陳龍，張彥，胡小三，彭利紅，李鳳，于意文，何琴莉

(南充市中心醫(yī)院消化內(nèi)科，四川 南充 637000)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease，IBD)包括克羅恩病(Crohn’s disease，CD)和潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)，是一組慢性復(fù)發(fā)性腸道炎癥性疾病[1]。近 20年來(lái)，我國(guó)炎癥性腸病的發(fā)生率不斷增加，已成為危害人民健康的常見(jiàn)和難治性的腸道疾病。由于該病病因及發(fā)病機(jī)制至今尚未完全清楚，治療上缺乏特異有效的藥物。錫類散作為一種傳統(tǒng)的中醫(yī)藥復(fù)方制劑，由青黛、硼砂、西瓜霜、寒水石、牛黃、珍珠、硇砂、冰片組成，具有清熱解毒、消腫止痛之功，主治咽喉腫痛、潰瘍，近年來(lái)逐漸用于治療潰瘍性結(jié)腸炎。四川大學(xué)華西醫(yī)院歐陽(yáng)欽教授研究團(tuán)隊(duì)在 2014 年發(fā)表的1篇臨床隨機(jī)對(duì)照研究表明：錫類散灌腸治療輕、中度活動(dòng)性潰瘍性結(jié)腸炎安全有效，且療效優(yōu)于激素(氫化可的松)灌腸[2]。馬熙淼等[3]的一項(xiàng)系統(tǒng)評(píng)價(jià)研究也表明：錫類散灌腸或聯(lián)合其他治療藥物如：激素、5-ASA等治療潰瘍性結(jié)腸炎總有效率和治愈率都優(yōu)于單獨(dú)其他藥物治療以及藥物聯(lián)合甲硝唑或氫化可的松灌腸等，且錫類散灌腸副作用更小，安全性更好。

然而，到目前為止，尚無(wú)關(guān)于錫類散對(duì)結(jié)腸樹突狀細(xì)胞作用的報(bào)道。本研究旨在從細(xì)胞學(xué)層面深入探討錫類散對(duì)結(jié)腸樹突狀細(xì)胞的影響，為研究錫類散治療IBD的機(jī)制提供依據(jù)。

1 研究方法

1.1 Balb/c小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(BMDC)的分離、誘導(dǎo)及鑒定

1.1.1 BMDC原代細(xì)胞的分離培養(yǎng) 參照Lutz等[4]的方法，采用粒細(xì)胞-集落刺激因子(GM-CSF)刺激法分離培養(yǎng)BMDC，具體步驟如下：(1)配制培養(yǎng)基：全培養(yǎng)基100 mL=RPMI-1640 90 mL+10 mL FBS+1 mL青鏈雙抗；DC培養(yǎng)基=全培養(yǎng)基+GM-CSF 2 μg。(2)動(dòng)物準(zhǔn)備：先將130 g左右的SD大鼠采用脫頸法處死，放入75%的酒精中浸泡3 min，滅菌處理。(3)培養(yǎng)皿標(biāo)記：在動(dòng)物房超凈臺(tái)中取出4個(gè)10 cm培養(yǎng)皿，分別標(biāo)注0、1、2、3。在0號(hào)培養(yǎng)皿中加入4 ℃ 75%酒精8 mL，在1、2、3號(hào)培養(yǎng)皿中分別加入8 mL 4 ℃ PBS。(4)分離股骨和脛骨：在膝關(guān)節(jié)處剪斷分離出股骨和脛骨，采用無(wú)菌紗布揉捏股骨和脛骨，以進(jìn)一步剝脫肌肉。(5)股骨和脛骨滅菌：將雙下肢股骨和脛骨置于0號(hào)培養(yǎng)皿75%酒精中浸泡3 min消毒。將股骨和脛骨依次轉(zhuǎn)移至1、2、3號(hào)PBS培養(yǎng)皿中，洗凈酒精后，將裝有股骨和脛骨PBS的培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至細(xì)胞房超凈臺(tái)。(6) 提取骨髓干細(xì)胞：在細(xì)胞房超凈臺(tái)中，分別將股骨和脛骨兩端用無(wú)菌剪刀剪去后，用10 mL注射器配上1 mL的針頭，吸取PBS沖擊骨髓腔，將骨髓干細(xì)胞沖入50 mL離心管中。將裝有骨髓干細(xì)胞的PBS懸液以1 500 rpm，10 min離心。用大移液管吸除上清液，得到細(xì)胞沉淀，加入全培養(yǎng)基 3 mL，然后用槍頭進(jìn)行吹打，使沉淀細(xì)胞吹打均勻。(7)過(guò)濾：將3 mL細(xì)胞懸液用槍頭吸出，用200的濾網(wǎng)進(jìn)行過(guò)濾后，再取7 mL的的全培養(yǎng)基沖洗濾網(wǎng)，一共在培養(yǎng)皿中得到10 mL的細(xì)胞懸液。(8)離心：將細(xì)胞懸液以1 500 rpm，10 min離心。(9)去除紅細(xì)胞：去上清，加入2 mL紅細(xì)胞裂解液，采用1 mL槍頭吹打均勻后，靜置3 min。(10) 離心：將加有紅細(xì)胞裂解液的細(xì)胞懸液以1 500 rpm離心10 min后去上清，兩次加入5 mL全培養(yǎng)基吹勻后離心去除紅細(xì)胞懸液。(11)種板：將離心后的細(xì)胞懸液采用DC培養(yǎng)基重懸后，接種至6孔板。

1.1.2 首次換液 (1)觀察細(xì)胞狀態(tài)：分化48 h后觀察細(xì)胞是否貼壁；(2)離心：將原細(xì)胞培養(yǎng)液吸入15 mL離心管中，1 500 rpm×10 min離心；(3)清洗：培養(yǎng)皿中加入4 ℃PBS進(jìn)行清洗2遍；(4)半量換液：原培養(yǎng)液離心后取半量上清液加入10 cm培養(yǎng)皿中，再取新鮮的DC培養(yǎng)基加入到培養(yǎng)皿中，繼續(xù)5% CO237 ℃培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)。

1.1.3 常規(guī)換液 (1)半量換液：繼續(xù)培養(yǎng)2 d后半量換液；(2)去除淋巴細(xì)胞：如果換液過(guò)程中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目過(guò)多，混雜有大量的淋巴細(xì)胞，采用離心分離法去除淋巴細(xì)胞后繼續(xù)培養(yǎng)；(3)收集細(xì)胞檢測(cè)：一般培養(yǎng)7 d的時(shí)候細(xì)胞分化完全，稱為樹突狀細(xì)胞，收集懸浮和貼壁細(xì)胞。一部分細(xì)胞直接用于流式檢測(cè)細(xì)胞表型；另一部分細(xì)胞采用脂多糖(lipopolysaccharides，LPS) 1 μg/mL干預(yù)24 h后進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)。

1.2 BMDC表型測(cè)定

1.2.1 收集細(xì)胞 (1)去上清：在分離培養(yǎng)的第7天，吸取BMDC和LPS干預(yù)后的BMDC的上清液；(2)清洗：采用4 ℃ PBS×2次沖洗兩組培養(yǎng)皿，并收集PBS；(3)消化：每個(gè)直徑為10 cm的培養(yǎng)皿中加入2 mL胰酶，反復(fù)吹打，放置于37 ℃孵育箱中孵育5 min，鏡下觀察細(xì)胞是否全部脫落；(4)中止消化：每個(gè)培養(yǎng)皿中加入4 mL全培養(yǎng)基中止胰酶消化；(5)收集細(xì)胞：收集所有細(xì)胞至離心管中，以1 500 rpm，離心10 min；(6)流式標(biāo)記：去凈上清，每個(gè)培養(yǎng)皿加入4 ℃ PBS 5 mL，吹勻，以1 500 rpm，離心10 min，洗2次后，采用PBS重懸，每組細(xì)胞轉(zhuǎn)移至4個(gè)流式管中備用。BMDC的流式管標(biāo)記為：DCC(BMDC control組)、DCO(BMDC染CD11c-FITC管)、DC80(BMDC染CD80-PE管)、DCX(BMDC染CD86-PE+CD40-FITC+MHCII-PerCP管)；LPS刺激后的BMDC流式管標(biāo)記為：LDCC、LDCO、LDC80、LDCX(染色同前)。

1.2.2 DC表型(CD11c，CD80、CD86、CD40和MHC-II)測(cè)定 (1)離心：將8個(gè)流式管以1 500 rpm，離心10 min，去凈PBS；(2)加液：每管中加入100 μL流式緩沖液(含1%血清的PBS)，采用槍頭吹打均勻；(3)流抗孵育：在暗室，4 ℃條件下，在DCO和LDCO中加入10 μL CD11c-FITC的流式抗體。在DC80和LDC80中加入10 μL CD80-PE的流式抗體。在DCX和LDCX中分別加入CD86-PE、CD40-FITC和MHCII-PerCP各10 μL。各流式管振蕩，吹打均勻，靜置孵育30 min；(4)清洗：在除了DCC和LDCC管外的6個(gè)流式管中加入2 mL流式緩沖液，振蕩，吹打均勻。在暗室條件下，各流式管以1 500 rpm，離心10 min；(5)上機(jī)：離心后去上清液，在暗室條件下，每管加入300 μL流式緩沖液，振蕩，吹打均勻后上機(jī)。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組

取小鼠骨髓源性樹突狀細(xì)胞(2×106/孔)接種于六孔板上，予以 RPMI-1640完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，分為4組：錫類散+DC組、錫類散+DC+LPS組、DC組和DC+LPS組。錫類散+DC組和錫類散+DC+LPS組指DC加入粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)刺激，同時(shí)加入無(wú)菌錫類散懸液刺激。DC組，指GM-CSF刺激骨髓干細(xì)胞6 d后的未成熟DC(iDC)；DC+LPS組指iDC在第6天加LPS(1 μg/mL)刺激24 h后形成的成熟DC(mDC)；錫類散+DC組指GM-CSF+錫類散共同刺激骨髓干細(xì)胞6 d后的DC；錫類散+DC+LPS組指GM-CSF+錫類散共同刺激骨髓干細(xì)胞6 d后，經(jīng)LPS(1 μg/mL)刺激24 h后的DC。

上述4組細(xì)胞在培養(yǎng) 6 d后，錫類散+DC組收集疏松貼壁細(xì)胞，即為錫類散干預(yù)后的樹突狀細(xì)胞；錫類散+C+LPS組加入 LPS(1 μg/mL)刺激誘導(dǎo) 24 h；DC組和DC+LPS組加入GM-CSF 刺激，DC組收集疏松貼壁細(xì)胞； DC+LPS組加 入 LPS(1 μg/mL)刺激誘導(dǎo)24 h。

1.4 錫類散對(duì)樹突狀細(xì)胞表型和分泌的細(xì)胞因子的影響

采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)四組細(xì)胞表面共刺激分子(CD80、CD86、 CD40)和MHC-II，并比較，以評(píng)價(jià)4組樹突狀細(xì)胞的成熟度和耐受性。采用 ELISA 技術(shù)檢測(cè)4組樹突狀細(xì)胞上清液中IL-10 的濃度。

2 結(jié)果

2.1 小鼠BMDC形態(tài)學(xué)觀察

如圖1所示，第6天BMDC為幼稚或者不成熟DC，DC形態(tài)呈圓形或類圓形，細(xì)胞周圍沒(méi)有毛刺，有些細(xì)胞呈成簇聚集的懸浮狀態(tài)。在加用LPS刺激后的第7天變?yōu)槌墒霥C，成熟DC形態(tài)為毛球狀，圓形或類圓形細(xì)胞表面可見(jiàn)較多小的毛刺樣突起。

2.2 BMDC的表型測(cè)定

如圖2所示：在iDC組中，86%～90%的細(xì)胞表達(dá)CD11c；mDC組中，有85%～89%的細(xì)胞表達(dá)CD11c。

2.3 iDC與mDC表面共刺激分子和MHC-II的表達(dá)差異

如圖3-圖6及表1所示：與iDC組比較，成熟樹突狀細(xì)胞(mDC)組的表面共刺激分子CD80、CD86、CD40和MHC-II表達(dá)明顯增加(P<0.05)。

表1 iDC與mDC表面共刺激分子的表達(dá)比較±s)

*P<0.05，與iDC組比較。

2.4 錫類散對(duì)BMDC表型的影響

如表2所示：與mDC相比，錫類散作用后的DC(錫類散+DC組和錫類散+DC+LPS組)表面共刺激分子CD80、CD86、CD40和MHC-II的表達(dá)明顯降低(P<0.05)，與iDC比較無(wú)明顯差異(P>0.05)。

組別CD80CD86CD40MHCIIiDC40.57±13.7849.43±21.9516.87±5.015.33±2.81mDC86.93±9.8978.10±12.6530.68±3.2539.4±12.6錫類散+DC38.97±5.8538.70±19.5510.70±5.0916.57±3.52錫類散+DC+LPS41.76±17.6558.50±16.1012.17±1.1717.27±2.80

2.5 錫類散對(duì)BMDC的IL-10分泌的影響

由圖7可見(jiàn)，與iDC組比較，錫類散誘導(dǎo)的DC組(錫類散+DC組和錫類散+DC+LPS組)，IL-10的分泌明顯增加(P<0.05)；而mDC組IL-10的分泌明顯減少(P<0.05)。

3 討論

樹突狀細(xì)胞(DC)是機(jī)體功能最強(qiáng)的專職抗原呈遞細(xì)胞(APC)，能高效地?cái)z取、加工處理和呈遞抗原，從而啟動(dòng)免疫應(yīng)答。DC啟動(dòng)免疫應(yīng)答具有雙重作用，一方面能促進(jìn)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的激活；另一方面又能誘導(dǎo)免疫耐受的產(chǎn)生，這種免疫激活和免疫耐受之間的平衡在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起著極其重要的作用[5]。

骨髓來(lái)源的iDC是DC中的一個(gè)亞型，在IBD的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著至關(guān)重要的作用。因此，研究者們?cè)谘芯縄BD與DC的關(guān)系時(shí)，常常把這種骨髓源性DC作為研究對(duì)象[6]。這也是本研究中我們選擇骨髓源性DC的原因。

骨髓源性DC起源于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)，需要誘導(dǎo)才能產(chǎn)生。目前國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的體外誘導(dǎo)骨髓MSCs向骨髓源性DC分化的方法，是粒細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)法[4]。本研究也采用了這一方法成功地用GM-CSF誘導(dǎo)骨髓MSCs轉(zhuǎn)化為BMDC。研究發(fā)現(xiàn)：GM-CSF刺激后，6 d就可誘導(dǎo)MSCs分化為未成熟DC。然而，要形成成熟DC還需要抗原或其他物質(zhì)的刺激。目前公認(rèn)的在體外刺激未成熟DC向成熟DC轉(zhuǎn)化的刺激物質(zhì)是LPS。本研究也使用LPS刺激成功地使iDC轉(zhuǎn)變成了mDC。

在BMDC分化成熟過(guò)程中，它的狀態(tài)經(jīng)歷了懸浮-貼壁-半懸浮的過(guò)程[7]；形態(tài)逐漸由未成熟DC呈圓形或類圓形，細(xì)胞周圍沒(méi)有毛刺，有些細(xì)胞呈成簇聚集的懸浮狀態(tài)，轉(zhuǎn)變成成熟DC，成熟DC呈毛球狀，圓形或類圓形，其細(xì)胞表面可見(jiàn)較多小的毛刺樣突起[8]。在本研究中，我們也觀察到了如上所述的DC分化成熟的整個(gè)形態(tài)學(xué)變化過(guò)程。

眾所周知，GM-CSF在誘導(dǎo)MSCs分化為樹突狀細(xì)胞時(shí)，經(jīng)歷了從前體細(xì)胞至未成熟DC(iDC)再到成熟DC(mDC)的過(guò)程。一般情況下，在攝取抗原之前，DC處于未成熟階段，稱為未成熟DC(iDC)，其特征是表面表達(dá)低水平的MHCII和共刺激分子(CD80、CD86和CD40)等激活T細(xì)胞所必須的輔助分子。相反，成熟DC則高表達(dá)T細(xì)胞激活所必須的共刺激分子和MHC-II。因此，DC表面共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II的表達(dá)被作為判定其成熟或未成熟的標(biāo)志[9-10]。本研究發(fā)現(xiàn)，iDC的共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II呈低表達(dá)，mDC的共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II呈高表達(dá)。這表明：從骨髓中分離誘導(dǎo)出iDC，經(jīng)LPS刺激后，變成了mDC。

鑒定誘導(dǎo)分化的DC是否就是樹突狀細(xì)胞，可通過(guò)鑒定其表面特異性標(biāo)志物來(lái)確定。目前的研究認(rèn)為，在DC的特異性標(biāo)志物上，不同種屬的DC，其特異性標(biāo)志物是不同的：小鼠和人的BMDC，通常采用CD11c作為特異性標(biāo)志物[8]；而在小鼠的BMDC中，公認(rèn)的特異性標(biāo)志物是CD11c。本研究發(fā)現(xiàn)：在iDC組中，86%～90%的細(xì)胞表達(dá)CD11c；mDC組中，有85%～89%的細(xì)胞表達(dá)CD11c，這表明：分離培養(yǎng)的骨髓細(xì)胞中，有85%～90%的細(xì)胞是BMDC。

IL-10是一種抑炎細(xì)胞因子，能抑制免疫，誘導(dǎo)免疫耐受[11-12]。在炎癥性腸病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，腸道IL-10的分泌不足，從而加重了腸道炎癥反應(yīng)。而IL-10的分泌不足被認(rèn)為與炎癥性腸病中腸道耐受性樹突狀細(xì)胞減少有關(guān)[13]。與iDC和mDC不同，tDC能分泌大量IL-10，從而抑制免疫，誘導(dǎo)免疫耐受。IL-10也被作為鑒別tDC與iDC和mDC的標(biāo)志[14]。本研究通過(guò)ELISA方法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中IL-10的濃度以鑒別iDC，mDC和tDC。

錫類散治療潰瘍性結(jié)腸炎不僅在臨床治療方面作用得到了國(guó)內(nèi)外的廣泛認(rèn)可[15]，在錫類散治療炎癥性腸病的動(dòng)物學(xué)研究方面，研究者們也做了一些研究，發(fā) 現(xiàn)錫類散對(duì)結(jié)腸炎模型小鼠有治療作用。2010年歐陽(yáng)欽教授研究團(tuán)隊(duì)研究發(fā) 現(xiàn)：錫類散灌腸可改善惡唑酮結(jié)腸炎模型小鼠結(jié)腸組織炎癥[2]。2016 年 Wen等[16]的研究表明：錫類散灌腸可使葡聚糖硫酸鈉結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織炎癥程度減輕。盡管錫類散灌腸治療潰瘍性結(jié)腸炎的臨床和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)都取得了較好的療效，然而研究多集中在錫類散減輕結(jié)腸炎癥，減少炎癥因子等方面。關(guān)于錫類散是否對(duì)結(jié)腸免疫細(xì)胞特別是重要的抗原呈遞細(xì)胞-樹突狀細(xì)胞的作用，到目前為止尚未見(jiàn)報(bào)道。

本研究通過(guò)將錫類散作用于BMDC，通過(guò)對(duì)樹突狀細(xì)胞表型進(jìn)行流式檢查及上清液進(jìn)行IL-10的ELISA檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)：與iDC比較，錫類散作用后的樹突狀細(xì)胞(錫類散+DC組)表面共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II無(wú)明顯變化。在LPS刺激后，錫類散作用后的樹突狀細(xì)胞表面共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II無(wú)明顯變化，而iDC在LPS刺激變?yōu)閙DC后，表面共刺激分子(CD80、CD86、CD40)和MHC-II明顯增加。而且，錫類散作用后的DC(錫類散+DC組和錫類散+DC+LPS組)IL-10的分泌明顯增加。這說(shuō)明錫類散作用后的DC能保持表面共刺激分子不變的狀態(tài)即免疫耐受狀態(tài)，這與血管活性腸肽(VIP)和維生素D3誘導(dǎo)的樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生耐受相似[17-18]。

本研究從細(xì)胞學(xué)層面證實(shí)了中藥復(fù)方制劑-錫類散能誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生耐受，促進(jìn)樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生的IL-10增加。這為進(jìn)一步研究錫類散治療結(jié)腸炎的動(dòng)物學(xué)機(jī)制及錫類散作用靶點(diǎn)和有效成分的開(kāi)發(fā)提供了依據(jù)。