諶珍，劉青茹，張曉偉，賀晶，孫軍燕，劉婧，*

（1.中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院，浙江杭州310016；2.煙臺(tái)北方茶葉推廣中心，山東煙臺(tái)264009）

近年來，以 γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）為功效因子的新型功能食品被廣泛開發(fā)應(yīng)用，GABA具有降壓、治療癲癇、增強(qiáng)記憶力等功效，而一般植物組織中的GABA含量很低，不能滿足人體生理需求，桑葉為藥食兩用原料，具有明顯的降血壓和降血糖功效，特別是其中所含的GABA含量平均能達(dá)到226 mg/100 g[1]，而且我國(guó)桑葉種植廣泛，是用來開發(fā)高γ-氨基丁酸茶的理想原料。桑葉中GABA是谷氨酸（glutamic acid，Glu）在谷氨酸脫羧酶的作用下水解而來，葉片中谷氨酸的含量也可以作為一個(gè)參照指標(biāo)評(píng)價(jià)桑葉中γ-氨基丁酸提高的潛力。所以準(zhǔn)確、高效測(cè)定桑葉中γ-氨基丁酸和谷氨酸的含量對(duì)于開發(fā)高γ-氨基丁酸桑葉茶尤為重要。

目前常用的測(cè)定γ-氨基丁酸的的方法主要分為高效液相色譜法[2-3]、Berthelot比色法[4-7]、改良紙層析法[8-9]。若采用紙層析法和比色法，因?yàn)樯Ｈ~內(nèi)質(zhì)成分復(fù)雜且含大量色素，會(huì)干擾γ-氨基丁酸和谷氨酸的測(cè)定，從而降低檢測(cè)的精確性和靈敏度。而高效液相法測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，可同時(shí)檢測(cè)多種氨基酸。常用氨基酸柱前衍生試劑有異硫腈酸苯酯（phenyl isothiocyanate，PITC）、鄰苯二甲醛（o-phthalaldehyde，OPA）、2，4-二硝基氟苯（2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB），PITC衍生時(shí)間短但操作繁雜，需要減壓蒸餾去除多余衍生劑；OPA衍生反應(yīng)迅速，但生成物不穩(wěn)定，需快速進(jìn)樣，所以本試驗(yàn)選用2，4-二硝基氟苯作為衍生試劑，用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定γ-氨基丁酸和谷氨酸含量。同時(shí)簡(jiǎn)化樣品前處理過程，確立提取的最佳參數(shù)，旨在建立準(zhǔn)確、高效的γ-氨基丁酸和谷氨酸檢測(cè)方法，為γ-氨基丁酸桑葉茶開發(fā)和利用提供理論與技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品：新鮮桑葉、中華全國(guó)供銷合作總社杭州茶葉研究院食品技術(shù)所自制GABA桑葉茶。

γ-氨基丁酸標(biāo)準(zhǔn)品（99%）、三乙胺、三水乙酸鈉（均為分析純）：阿拉丁公司；乙腈（色譜純）：德國(guó)默克股份兩合公司；乙酸：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；谷氨酸鈉（食用級(jí)）：河南思遠(yuǎn)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀（配Waters 1525泵、Waters717 plus自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2487紫外檢測(cè)器）：美國(guó)Waters公司；DU-S26電熱恒溫水浴鍋：上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；XW-80A旋渦混合器：上海精科實(shí)業(yè)有限公司；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長(zhǎng)城工貿(mào)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液配制

1）2，4-二硝基氟苯衍生溶液、pH 9.0硼酸緩沖溶液和pH 7.0磷酸緩沖溶液的配制參照文獻(xiàn)[10]。

2）梯度洗脫溶液

A相：50 mmol/L pH 6.8乙酸鈉緩沖溶液，（含1%三乙胺）。稱取3.402 g三水乙酸鈉，用娃哈哈純凈水定容至500 mL，加入0.5 mL三乙胺，0.5 mL冰乙酸，有機(jī)濾膜過濾，并超聲脫氣20 min。

B相：50%乙睛水溶液，體積比為1∶1。有機(jī)濾膜過濾，并超聲脫氣20 min。

1.3.2 衍生、上樣

取 200 μL 待測(cè)液，加 200 μL 硼酸鈉緩沖液，20 μL DNFB，封口膜密封，混勻，60℃暗處水浴1 h。室溫冷卻，加400 μL磷酸鹽緩沖液，搖勻，過 0.22 μm膜。

用pH 9.0硼酸緩沖溶液配制0.01、0.02、0.03mg/mL谷氨酸和γ-氨基丁酸混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其余操作待測(cè)液。

1.3.3 色譜條件

流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)360 nm；柱溫23℃；進(jìn)樣量10 μL。梯度洗脫，洗脫程序參照文獻(xiàn)[11]。

1.3.4 樣品提取試驗(yàn)

分別稱取桑葉茶粉 0.05、0.1、0.3、0.6、1.2 g 置于15 mL離心管中，加10 mL沸水，100℃水浴20 min，每5 min搖晃一次。冷卻至室溫，3 500 r/min離心10 min，上清轉(zhuǎn)移至25 mL容量瓶。重復(fù)提取一次，合并提取液定容至25 mL。按照提取所用溶劑體積20 mL計(jì)算料液比，考察料液比 2.5∶1、5∶1、15∶1、30∶1、60∶1（mg/mL）對(duì)GABA和Glu提取量的影響；在料液比5∶1（mg/mL）的基礎(chǔ)上，探究提取溫度70、80、90、100℃對(duì) GABA和Glu 提取量的影響；在料液比 5∶1（mg/mL）與提取溫度80℃基礎(chǔ)上，設(shè)定單次提取時(shí)間分別為10、15、20、25 min，考察提取時(shí)間對(duì)GABA和Glu提取量的影響。

1.3.5 線性檢驗(yàn)

用pH9.0硼酸緩沖液配制0～0.05 mg/mL質(zhì)量濃度的混標(biāo)，分別取200 μL進(jìn)行衍生和色譜分析，測(cè)試結(jié)果以質(zhì)量濃度為x軸，峰面積為y軸作線性方程，并進(jìn)行線性回歸分析。

1.3.6 精確性和準(zhǔn)確性驗(yàn)證試驗(yàn)

樣品重復(fù)性試驗(yàn)：按上述方法處理桑葉茶，重復(fù)測(cè)定5次，計(jì)算測(cè)定結(jié)果得平均值和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。

樣品加標(biāo)回收率：以桑葉茶為空白，添加已知質(zhì)量濃度的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行色譜測(cè)定，計(jì)算其加標(biāo)回收率。

1.3.7 桑葉富集GABA實(shí)施方案

每2 m2的桑樹地澆10 L的濃度為5%谷氨酸鈉（monosodium glutamate，MSG）溶液，桑樹栽種株間距0.5 m，行間距1 m。7天后采樣，同時(shí)重復(fù)上述操作，過7天后再采樣。采樣分上位葉（2葉～4葉）、中位葉（6葉～8葉）、下位葉（倒數(shù)三葉）。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取參數(shù)優(yōu)化

樣品中GABA和Glu提取率的高低直接影響檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性，本文從提取料液比、時(shí)間、溫度幾個(gè)方面對(duì)提取過程進(jìn)行優(yōu)化。GABA和Glu都極易溶于熱水，所以選擇以蒸餾水為提取溶劑，加熱浸提的方式。

2.1.1 料液比

料液比對(duì)Glu和GABA提取量的影響見圖1。

圖1 料液比對(duì)Glu和GABA提取量的影響Fig.1 The effect of solid-liquid ratio on the extraction of Glu and GABA

此處料液比為樣品質(zhì)量與兩次提取總?cè)軇┨崛≈?，通過圖 1 可以看出，料液比為 5∶1（mg/mL）時(shí)提取的Glu和GABA含量最高，Glu含量為（0.65±0.02）mg/g，GABA 為（1.92±0.02）mg/g，在 2.5 mg/mL 時(shí)稍低但差異不顯著；從料液比 5∶1（mg/mL）之后，GABA和Glu含量均隨料液比的增大而降低，可能原因是樣品多溶劑少導(dǎo)致提取不完全；總體上Glu與GABA提取率的變化趨勢(shì)一致，且料液比5∶1（mg/mL）提取效果最佳。

2.1.2 提取溫度

提取溫度對(duì)Glu和GABA提取量的影響見圖2。

提取溫度影響提取效率，試驗(yàn)通過以不同溫度對(duì)桑葉進(jìn)行提取，結(jié)果顯示，70℃提取的Glu與GABA含量顯著低于其他試驗(yàn)組，80℃到100℃變化不大，同時(shí)Glu與GABA提取含量的變化趨勢(shì)一致，最終選取提取溫度80℃。

2.1.3 提取時(shí)間

提取時(shí)間對(duì)Glu和GABA提取量的影響見圖3。

圖2 提取溫度對(duì)Glu和GABA提取量的影響Fig.2 The effect of extraction temperature on the extraction of Glu and GABA

圖3 提取時(shí)間對(duì)Glu和GABA提取量的影響Fig.3 The effect of extraction time on the extraction of Glu and GABA

提取總時(shí)間按照兩次浸提時(shí)間之和，由圖3可以看出，Glu和GABA提取量隨時(shí)間延長(zhǎng)變化均不顯著，Glu含量在（0.59±0）mg/g到（0.61±0.01）mg/g之間，GABA 含量在（1.85±0.06）mg/g到（1.92±0.02）mg/g之間，所以選取提取時(shí)間10 min。

綜合上述試驗(yàn)結(jié)果，料液比、提取溫度對(duì)Glu和GABA提取效果有較大影響，通過不同參數(shù)比較，確定最佳提取條件為：80℃條件下，料液比5∶1（mg/mL），分兩次浸提，每次5 min。

2.2 線性檢驗(yàn)

Glu和GABA濃度與峰面積線性回歸關(guān)系見圖4、圖5。

圖4 Glu濃度與峰面積線性回歸關(guān)系Fig.4 The linear regression relationship between Glu concentration and peak area

圖5 GABA濃度與峰面積線性回歸關(guān)系Fig.5 The linear regression relationship between GABA concentration and peak area

試驗(yàn)設(shè)置不同質(zhì)量濃度的Glu和GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，結(jié)果顯示在0～0.05 mg/mL范圍內(nèi)Glu的線性方程為y=2×107x-7 997.2，GABA的線性方程為y=2×107x+6 418.4，兩者的相關(guān)系數(shù)分別為0.998 9、0.999 5，線性關(guān)系良好。

圖6為標(biāo)樣中Glu和GABA的液相色譜圖。

2.3 穩(wěn)定性檢驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)是評(píng)價(jià)分析系統(tǒng)穩(wěn)定性的重要方法，通常采用樣品保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）作為考察對(duì)象。選用同一樣品連續(xù)進(jìn)樣5次，結(jié)果如表2。

圖6 標(biāo)樣中Glu和GABA分離圖譜Fig.6 The separation spectrogram of Glu and GABA in standard sample

表2 重復(fù)性檢驗(yàn)（n=5）Table 2 The repetition test of retention time and peak area

通過表2可以看出，Glu的保留時(shí)間在9 min～10 min，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.759%，GABA的保留時(shí)間在33 min～34 min，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.718%；另外Glu和GABA的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.672%、1.246%，均小于5%，說明此檢測(cè)方法的精密度達(dá)到了較高水平。

2.4 加標(biāo)回收率

在同一份桑葉茶樣品中，分別添加0.005、0.01mg/mL的氨基酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算其加標(biāo)回收率，結(jié)果如表3。

表3 加標(biāo)回收率Table 3 Rate of recovery of Glu and GABA adding to the sample

經(jīng)計(jì)算Glu和GABA的平均加標(biāo)回收率分別為88.024%、114.64%，回收率在80%～120%之間，說明此方法具有較高的可靠性。

2.5 樣品測(cè)定

以富集GABA的桑樹鮮葉為樣品，按照上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表4。

表4 桑葉樣品中Glu和GABA含量Table 4 The content of Glu and GABA in mulberry leaf samples

由表4可以看出，通過給桑樹澆灌谷氨酸鈉溶液，桑葉谷氨酸含量自第一次澆灌后即有明顯增加，不同葉位之間含量相差不大；二次澆灌后桑葉中谷氨酸含量與一次澆灌基本保持一致，說明桑樹對(duì)谷氨酸鈉的吸收可能具有一定限度或者一部分流失或轉(zhuǎn)化成其他形式。而GABA含量在一次澆灌后上升幅度較小，二次澆灌后含量顯著提高，說明通過澆灌谷氨酸鈉溶液對(duì)GABA富集效果好，且轉(zhuǎn)化過程需要一定時(shí)間，后續(xù)可對(duì)其吸收轉(zhuǎn)化機(jī)制進(jìn)行更深入的試驗(yàn)。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)桑葉前處理的摸索，確定最佳提取條件為：80 ℃條件下，料液比 5∶1（mg/mL），分兩次浸提，每次5 min。建立了一種快速、簡(jiǎn)單、精準(zhǔn)的同時(shí)測(cè)定桑葉源谷氨酸和γ-氨基丁酸的方法，該方法能有效分開目標(biāo)物質(zhì)與干擾物質(zhì)，且Glu和GABA的峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.672%、1.246%，平均加標(biāo)回收率分別為88.024%、114.64%，具有較高的可靠性。另外試驗(yàn)所用的紫外檢測(cè)器比熒光檢測(cè)器普及率高，具有更高的通用性。

采用此檢測(cè)方法測(cè)定富集GABA的桑葉中Glu和GABA含量，發(fā)現(xiàn)通過澆灌谷氨酸鈉可以達(dá)到較好的富集效果，為提高GABA含量提供可靠、快速的檢測(cè)手段，后續(xù)還可深入探究桑樹對(duì)谷氨酸鈉的吸收及轉(zhuǎn)化機(jī)制。