李 晗，趙 枰，陳 相

（南通市第一人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，江蘇226001）

自身免疫性疾病（autoimmune diseases,AID）發(fā)病原因多樣,可能與微生物感染、細(xì)胞基因突變有關(guān),亦可能原因不明,但最終都引起機(jī)體細(xì)胞免疫異常和免疫調(diào)節(jié)功能紊亂。免疫系統(tǒng)對(duì)自身組織、器官和細(xì)胞產(chǎn)生異常免疫應(yīng)答反應(yīng)[1-3],導(dǎo)致組織器官功能障礙。目前診斷自身免疫性疾病仍是在結(jié)合臨床表現(xiàn)的基礎(chǔ)上,依賴實(shí)驗(yàn)室檢查。在患者外周血中檢測(cè)抗核抗體（antinuclear antibody,ANA）、ANA熒光核型和抗核抗體譜（antinuclear antibodies,ANAs）是較為常用而重要的自身免疫性疾病的診斷方法[4-5]。本研究回顧性分析本院2017年11月—2018年4月住院的申請(qǐng)抗核抗體譜檢測(cè)的標(biāo)本982例,比較間接免疫熒光法（indirect immunofluorescenc,IIF）篩查ANA熒光核型與線性免疫印跡分析法（line immunoassay,LIA）檢測(cè)ANAs特異性抗體的結(jié)果,分析二者檢測(cè)間的相互關(guān)系及臨床意義,為臨床AID的診斷提供可靠依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 982例標(biāo)本同時(shí)采用IIF法檢測(cè)ANA和LIA檢測(cè)ANAs 15項(xiàng),其中確診AID 65例,非AID患者917例,包括疑似AID 99例,其他疾病712例,無(wú)明確診者104例。AID診斷符合國(guó)際相關(guān)學(xué)會(huì)的診療指南。送檢標(biāo)本均為清晨空腹靜脈血。

1.2 IIF法檢測(cè)ANA熒光核型 采用德國(guó)歐蒙醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室診斷股份公司HEP-2和靈長(zhǎng)類肝組織冰凍切片的組合IIF法檢測(cè)血清ANA。德國(guó)歐蒙PML型熒光顯微鏡判讀結(jié)果,以抗體滴度≥熒光100為陽(yáng)性。將1∶100 PBS吐溫緩沖液稀釋的血清標(biāo)本與抗原基質(zhì)片在載片反應(yīng)區(qū)反應(yīng),溫育30 min,流水沖洗2 s,浸泡5 min,加入熒光標(biāo)記的二抗,避光孵育30 min,流水沖洗2 s,浸泡5 min,加甘油封片后熒光顯微鏡下判讀結(jié)果。嚴(yán)格按照試劑操作說(shuō)明書操作。

1.3 LIA法檢測(cè)ANAs 采用德國(guó)歐蒙（杭州）醫(yī)學(xué)診斷有限公司檢測(cè)試劑,含有15個(gè)測(cè)定項(xiàng)目：抗nRNP/Sm、抗 Sm、抗 SSA、抗 R052、抗 SSB、抗 SCL-70、抗 PM-Scl、抗 J0-1、抗 CENP B、抗核小體抗體、抗PCNA、抗ds-DNA、抗組蛋白抗體、抗核糖體P蛋白抗體、抗AMA-M2。采用配套軟件EURO LineScan進(jìn)行顯色結(jié)果灰度值掃描分析,灰度值0～5為陰性（-）,6～10 為臨界（±）,≥11為陽(yáng)性（+）。膜條上平行包被經(jīng)親和層析純化的天然抗原,其中CENP B、PM-Scl、Ro-52、PCNA 為重組抗原。1∶101 稀釋的血清標(biāo)本1.5 mL與膜條上靶抗原反應(yīng)30 min,洗滌3次,5 min/次,加入1.5 mL酶標(biāo)記抗人IgG（酶結(jié)合物）溫育30 min,洗滌3次,5 min/次,加入底物液反應(yīng)15 min,蒸餾水清洗膜條終止反應(yīng),風(fēng)干后掃描。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計(jì)數(shù)資料以率表示,差異性比較采用χ2檢驗(yàn),以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 IIF和LIA檢測(cè) 982例標(biāo)本中,至少一種方法陽(yáng)性218例,陽(yáng)性率22.20%,單獨(dú)IIF檢測(cè)陽(yáng)性207例,陽(yáng)性率21.08%,單獨(dú)LIA檢測(cè)陽(yáng)性147例,陽(yáng)性率 14.97%,IIF 檢測(cè)陽(yáng)性率高于 LIA（P＜0.01）,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 IIF陽(yáng)性標(biāo)本各種核型的陽(yáng)性率 IIF檢測(cè)ANA陽(yáng)性標(biāo)本207例中以抗體高滴度為主,各核型陽(yáng)性率依次為均質(zhì)型72例（34.78%）,顆粒型70例（33.8%）,胞質(zhì)顆粒型37例（17.87%）,核仁型16例（7.73%）,著絲點(diǎn)型11例（5.31%）,胞漿纖維型1例（0.48%）,表明ANA核型以均質(zhì)型與顆粒型為主,提示自身免疫性疾病以 SLE、RA、MCTD、PSS、PM/DM 為主。

2.3 LIA陽(yáng)性標(biāo)本各特異性抗體的陽(yáng)性率 LIA法檢測(cè)ANAs陽(yáng)性標(biāo)本147例中抗nRNP/Sm 22例（14.97%）,抗 Sm 4例（2.72%）,抗 SSA 48例（32.65%）,抗SSB 8例（5.44%）,抗Ro-52 49例（33.33%）,抗SCL-70 1例（0.68%）,抗Jo-1 1例（0.68%）,抗 PM-Scl 0例,抗 CENP B 11例（7.48%）,抗PCNA 1例（0.68%）,抗dsDNA 4例（2.72%）,抗核小體3例（2.04%）,抗組蛋白2例（1.36%）,抗核糖體P蛋白8例（5.44%）,抗AMAA2 10例（6.80%）。如ANAs中單個(gè)抗體陽(yáng)性時(shí)應(yīng)結(jié)合臨床及隨訪,以防自身免疫性疾病的漏診。

2.4 自身免疫疾病組和非自身免疫疾病組ANA及ANAs陽(yáng)性率比較 ANA在自身免疫性疾病組的陽(yáng)性率（96.92%）顯著高于非自身免疫性疾病組（13.09%）,ANAs在自身免疫性疾病組的陽(yáng)性率（73.85%）也顯著高于非自身免疫性疾病組（7.96%）,在自身免疫性疾病組中ANA與ANAs檢測(cè)陽(yáng)性率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 自身免疫疾病組和非自身免疫疾病組ANA及ANAs陽(yáng)性率比較 n（%）

3 討 論

自身免疫性疾病病程中存在特征性的自身抗體譜,是診斷自身免疫性疾病的重要依據(jù),也是觀察病情和判斷療效的主要指標(biāo)。近年來(lái)IIF法是國(guó)內(nèi)ANA常規(guī)初篩方法：基質(zhì)（Hep-2細(xì)胞和猴肝片）容易制備,含有的抗原譜較完整,敏感度高,特異性強(qiáng),并可產(chǎn)生可判讀的特征性熒光[6]。但該法以手工操作為主,難以標(biāo)準(zhǔn)化,讀片有一定主觀性,結(jié)果準(zhǔn)確性很大程度上取決于檢驗(yàn)師的經(jīng)驗(yàn)[7]。ANAs檢測(cè)逐漸完善并廣泛開展,對(duì)特異性抗體檢測(cè)有助于明確診斷。ANA-LIA操作簡(jiǎn)便,一次可檢測(cè)多種特異性自身抗體,且有較高的敏感性和特異性,因此,作為ANA檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”的IIF法受到嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)[8-10]。

本研究對(duì)IIF法檢測(cè)ANA與LIA法檢測(cè)ANAs的結(jié)果進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)單獨(dú)IIF檢測(cè)的陽(yáng)性率高于單獨(dú)LIA檢測(cè),可能的原因是IIF抗原基質(zhì)包含的抗原種類比LIA檢測(cè)ANAs的抗原種類多,且IIF法中載玻片上覆蓋的基質(zhì)抗原分布均勻。但I(xiàn)IF抗原基質(zhì)中抗原含量遠(yuǎn)低于LIA法,因而IIF法檢測(cè)導(dǎo)致幾乎所有種類ANAs特異性抗體的漏檢。其次,雖然可通過(guò)對(duì)IIF檢測(cè)的ANA熒光模型進(jìn)行分析,初步判斷相應(yīng)抗體的性質(zhì),但同種抗體可出現(xiàn)不同的熒光模型,不同抗體亦也可出現(xiàn)相同的熒光模型,因此熒光模型只具有一定的提示作用,不能準(zhǔn)確反映靶抗原。本研究結(jié)果顯示,自身免疫性疾病組ANA陽(yáng)性檢出率、ANAs陽(yáng)性檢出率明顯高于非自身免疫性疾病組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。在自身免疫性疾病患者中,兩種方法檢出率的差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）,與文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相符[11]。ANA陽(yáng)性、ANAs陰性的可能原因：（1）所用的ANA-LIA法膜條只能檢測(cè)15種特異性自身抗體,ANA-IIF陰性不排除有其他特異性抗體的存在；（2）膜條上可溶性抗原包被不牢固,操作過(guò)程中可被洗去而出現(xiàn)LIA假陰性等[12-13]。ANA陰性、ANAs陽(yáng)性的可能原因：（1）血清中其他抗體效價(jià)較強(qiáng),在IIF檢測(cè)中自身抗體被遮蔽,而在LIA法單條帶分析中被捕獲顯現(xiàn)；（2）基質(zhì)（Hep-2細(xì)胞和猴肝片）細(xì)胞不是某些抗體的最佳檢測(cè)基質(zhì)細(xì)胞,如Jo-1抗體,且基質(zhì)細(xì)胞抗原成分可能不均勻分布、含量低,以及不同固定方法可能對(duì)特定抗原的抗原性的破壞等因素[14-15]。

綜上所述,臨床上對(duì)自身免疫性疾病進(jìn)行篩查時(shí),單獨(dú)采用IIF檢測(cè)ANA,可能因?yàn)榉椒▽W(xué)的差異而漏檢ANA譜陽(yáng)性樣本；而LIA檢測(cè)ANAs因自身抗體數(shù)量有限,亦容易導(dǎo)致自身免疫性疾病漏診。因此,臨床上篩查自身免疫性疾病應(yīng)進(jìn)行IIF-ANA和LIF-ANAs的聯(lián)合檢測(cè),避免僅采用一種方法檢測(cè)導(dǎo)致的漏診,為自身免疫疾病的準(zhǔn)確診斷和及時(shí)治療提供有力的幫助。