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庫蠓(CulicoidesLatreille)俗稱“墨蚊”、“小咬”，隸屬于昆蟲綱(insecta)、雙翅目(diptera)、蠓科(ceratopogonidae)，全世界現(xiàn)有1 368種、中國已知348種[1-2]，是引起野生和家養(yǎng)反芻動物流行病的重要媒介昆蟲，其通過刺吸動物血液來傳播藍(lán)舌病(BT)、家畜流行病出血熱(EHD)、非洲馬瘟病(AHS)等諸多動物傳染病[3]。上述疾病的病原通過媒介庫蠓和易感宿主之間的一系列復(fù)制循環(huán)而持續(xù)存活于自然界中[4]，因而其易于引發(fā)醫(yī)療衛(wèi)生和獸醫(yī)等領(lǐng)域的家畜流行病，從而造成牛、羊等養(yǎng)殖業(yè)的巨大經(jīng)濟(jì)損失，歐洲曾發(fā)生過藍(lán)舌病大流行[5-6]，國內(nèi)云南、廣西、新疆和內(nèi)蒙古等29個省也曾先后在牛羊血液中檢測出藍(lán)舌病病毒(BTV)[7]。目前，BT和AHS已被世界動物衛(wèi)生組織(OIE)列為A類傳染病[8]，中國也將BT列為一類動物疫病[9]。

庫蠓體型微小、鑒別特征稀少，傳統(tǒng)分類鑒定尚存在諸多問題。首先是非成蟲階段的蟲態(tài)和蟲體殘缺的成蟲均難以鑒定，其次受庫蠓性別限制，雄蟲借助外生殖器等形態(tài)特征易于鑒別，而雌蟲缺乏良好的尾器特征而不易鑒別，最后庫蠓表型可塑性和遺傳可變性等也容易導(dǎo)致誤判[10-12]。因此，庫蠓分類中亟需快速、準(zhǔn)確鑒定種類的技術(shù)方法，對蠓傳疾病的監(jiān)控、防治具有重要意義。

隨著分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，分子生物學(xué)技術(shù)已應(yīng)用于昆蟲分類鑒定和系統(tǒng)演化等領(lǐng)域，這在很大程度上彌補(bǔ)了傳統(tǒng)形態(tài)分類的不足，尤其是近似種或隱種的分類[13-15]。在昆蟲核基因中，串聯(lián)重復(fù)是核糖體DNA(rDNA)的存在形式，同時其一個轉(zhuǎn)錄單元包括18S、5.8S、28S三個部分，而ITS1和ITS2兩個可變區(qū)則分別位于18S和5.8S以及5.8S 和28S之間[16]。目前，昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究也主要集中在rDNA的ITS、28S rRNA和18S rRNA等區(qū)域。高度保守的序列通常應(yīng)用于高級分類階元的系統(tǒng)發(fā)育研究，如28S rRNA和18S rRNA[17]；而變異較大、選擇壓力小的序列則適用于種屬水平上的研究，如ITS1和ITS2序列[18]，且已廣泛應(yīng)用于媒介昆蟲的種類鑒定[19-20]。然而，蠓科昆蟲的分子系統(tǒng)學(xué)研究，自1992年Tabachnick等[21]報道變翅庫蠓(Culicoidesvariipennis)種群的基因差異開始，之后國外關(guān)于蠓科分子系統(tǒng)學(xué)的研究與日劇增[22-26]，但國內(nèi)相關(guān)研究嚴(yán)重不足。

因此，本研究以埃蠓屬的環(huán)紋埃蠓Alloheleaannulata為外群，對庫蠓屬中的凹緣庫蠓C.holcus、連斑庫蠓C.jacobsoni、印度庫蠓C.indianus、荒川庫蠓C.arakawai、霍飛庫蠓C.huffi和肩宏庫蠓C.humeralis等6種庫蠓進(jìn)行分類研究(凹緣庫蠓C.holcus、和連斑庫蠓C.jacobsoni為二囊亞屬近似種)，通過聯(lián)合形態(tài)學(xué)特征和核糖體DNA-ITS1序列數(shù)據(jù)，彌補(bǔ)傳統(tǒng)形態(tài)鑒定的不足，進(jìn)一步證實(shí)ITS1序列在庫蠓及其近似種的分類鑒別方面的適用性，為解決蠓科昆蟲分類中形態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)難以解決的問題提供更多的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1庫蠓標(biāo)本 本研究共使用7種23只蠓蟲標(biāo)本的數(shù)據(jù)，其中18只為本研究組2015年7月采自廣西大瑤山自然保護(hù)區(qū)，其余5只的數(shù)據(jù)來自GenBank數(shù)據(jù)庫，詳見表1。

1.1.2主要試劑及儀器 基因組提取試劑盒(QIAGEN, 德國)、pEASY-T1克隆試劑盒(北京全式金公司, 中國)、PCR MasterMix(TIANGEN, 中國)、引物(上海捷瑞生物工程有限公司)、瓊脂糖凝膠回收試劑盒(TIANGEN, 中國)、瓊脂糖(Biowest Agarose, 西班牙)、PCR擴(kuò)增儀(美國BOI-RAD公司)、UVP凝膠成像系統(tǒng)(美國BOI-RAD公司)等。

1.2 方法

1.2.1庫蠓采集 采用網(wǎng)捕法和燈誘法，在廣西大瑤山自然保護(hù)區(qū)不同生境設(shè)置采樣點(diǎn)進(jìn)行蠓蟲收集，并將其保存于無水乙醇中。

1.2.2標(biāo)本鑒定 按照常規(guī)方法進(jìn)行標(biāo)本的分選、解剖、制片、鑒定以及拍照，且胸部標(biāo)本單獨(dú)編號保存在無水乙醇中。

1.2.3基因組DNA 將庫蠓標(biāo)本研磨至無明顯組織塊，按照QIAGEN DNeasy Blood& Tissue Kit說明書進(jìn)行其基因組DNA提取，并保存至-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4PCR擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增的上游引物為PanCulF (5′-GTAGGTGAACCTGCGGAAGG-3′)，下游引物為PanCulR (5′-TGCGGTCTTCATCGACCCAT-3′)，由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增的體系如表2所示，其反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 30 s，40 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)5次；94 ℃ 60 s，44 ℃ 60 s，68 ℃ 60 s，循環(huán)35次；最后68 ℃延伸10 min。

表1 供試庫蠓的詳細(xì)信息Tab.1 Detailed information of the biting midges in this study

表2 PCR擴(kuò)增體系Tab.2 PCR amplification system

1.2.5PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、克隆及測序 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，同時利用DNA回收試劑盒進(jìn)行DNA產(chǎn)物的純化，之后使用pEASY-T1克隆試劑盒進(jìn)行DNA克隆，最后用60%甘油保存陽性克隆菌液并送至上海生物工程股份有限公司進(jìn)行雙向測序。

1.2.6rDNA-ITS1序列分析 利用Clustal X、DNA MAN、MEGA 6.06等軟件對本研究中rDNA-ITS1序列進(jìn)行比對、編輯、比較等分析，統(tǒng)計序列中各堿基(A、T、C、G)的組成比例以及保守位點(diǎn)(Conserved sites, C)、變異位點(diǎn)(Variable sites, V)、簡約信息位點(diǎn)(Parsim-Imformative sites, Pi)和自裔位點(diǎn)(Singleton sites, S)的數(shù)量。同時，以Kimura雙參數(shù)模型計算遺傳距離，并以環(huán)紋埃蠓A.annulata為外群，通過鄰接法(NJ)、最大似然法(ML)構(gòu)建分子系統(tǒng)樹，并通過Bootstrap 1 000次自舉檢驗(yàn)系統(tǒng)樹中各結(jié)點(diǎn)的置信值。

1.2.7統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩兩比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1形態(tài)學(xué)特征對比 本研究內(nèi)群的6種庫蠓形態(tài)上比較接近，尤其是凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni最為近似，以凹緣庫蠓C.holcus、連斑庫蠓C.jacobsoni和荒川庫蠓C.arakawai為例(表3、圖1)進(jìn)行形態(tài)特征比較。上述3種庫蠓中雄蟲可根據(jù)其尾器的4個特征進(jìn)行有效鑒別，但雌蟲中僅荒川庫蠓C.arakawai可直接根據(jù)頭部、翅部和腹部的明顯差異進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分，另外二囊亞屬的兩近似種除翅部特征的細(xì)微差別外，余未見差異，故鑒定非常困難。

表3 本研究三種庫蠓形態(tài)特征對比Tab.3 Comparison of morphological features of three Culicoides

1：凹緣庫蠓C.holcus；2：連斑庫蠓C.jacobsoni；3：印度庫蠓C.indianus；4：荒川庫蠓C.arakawai(雌)；5：荒川庫蠓C.arakawai(雄)；6：環(huán)斑埃蠓A.annulata；7：霍飛庫蠓C.huffi；8：肩宏庫蠓C.humeralis圖1 庫蠓近似種一側(cè)翅圖Fig.1 Wing of one side of sibling species

2.2DNA序列分析 本研究獲得的DNA序列經(jīng)Clustal W比對和人工校對后，得到rDNA-ITS1的序列長度為352 bp，該序列中存在較多的插入和缺失位點(diǎn)。通過MEGA 6.06軟件分析ITS1序列中T、C、A、G四種堿基的平均含量分別為36.8%、13.0%、30.0%和20.1%，其中A+T平均含量約為66.8%，C+G平均含量約為33.1%；而在3個密碼子位點(diǎn)中，第1位點(diǎn)的A+T含量相對最高(67.7%)，第3位點(diǎn)A+T平均含量相對最低(64.6%)。此外，ITS1序列中保守位點(diǎn)(C)、變異位點(diǎn)(V)、簡約信息位點(diǎn)(Pi)和自裔位點(diǎn)(S)的個數(shù)分別為163、189、182和7，其中變異位點(diǎn)(V)占比約為53.7%。

2.3序列同源性比對 將本研究所獲全部庫蠓ITS1序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行同源比對，搜索到部分同源序列，即荒川庫蠓C.arakawai(登錄號：AB462265、AJ489503，序列相似度：99%)、連斑庫蠓C.jacobsoni(登錄號：AB462262，序列相似度：97%)、印度庫蠓C.indianus(登錄號為AB462268，序列相似度：93%)。

2.4遺傳距離 利用MEGA 6.06軟件計算本研究中蠓蟲ITS1序列的遺傳距離，種內(nèi)和種間的遺傳距離范圍分別為0.000～0.020和0.113～0.621，通過統(tǒng)計軟件分析得出種內(nèi)組和種間組的遺傳距離(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)分別為0.009±0.008和0.391±0.169，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(t=32.430,P<0.05)。

2.5系統(tǒng)發(fā)育分析 以環(huán)紋埃蠓A.annulata為外群，采用鄰接法(NJ)和最大似然法(ML)分別構(gòu)建6種庫蠓的系統(tǒng)發(fā)育樹，得到基本一致的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)(圖2、3)。系統(tǒng)發(fā)育樹聚類分析表明：1)各物種間分別構(gòu)成單系(群)，同種不同地理種群聚為一支，且種間無交叉。2)物種間親緣關(guān)系明顯，二囊亞屬的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni兩種首先聚在一起，親緣關(guān)系較近并構(gòu)成一個姊妹群，再與庫蠓亞屬的印度庫蠓C.indianus并為一大支，同時帶紋亞屬的荒川庫蠓C.arakawai與三囊亞屬的肩宏庫蠓C.humeralis親緣關(guān)系較近先聚為一小支，再與屋室亞屬的霍飛庫蠓C.huffi結(jié)合構(gòu)成一大支，之后兩大支聚合形成內(nèi)群，而外群埃蠓屬的環(huán)紋埃蠓A.annulata在樹的根部，外群與內(nèi)群形成完整的有根樹。

各分支上的數(shù)字為自舉檢驗(yàn)置信值1 000次圖2 基于rDNA-ITS1序列構(gòu)建的NJ樹Fig.2 Neighbor-Joining tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

各分支上的數(shù)字為自舉檢驗(yàn)置信值1 000次圖3 基于rDNA-ITS1序列構(gòu)建的ML樹Fig.3 Maximum Likelihood tree constructed based on rDNA-ITS1 sequence

3 討 論

核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)1 (nuclear ribosomal DNA internal transcribed spacer 1, rDNA-ITS1)基因位于核糖體DNA的18S和5.8S之間，其特點(diǎn)為：①屬于中度重復(fù)序列；②不承擔(dān)編碼蛋白質(zhì)的功能，也不參與核糖體的形成，故承受的選擇壓力較小，進(jìn)化速度相對較快，從而具有高變性；③在ITS1序列兩側(cè)的18S和5.8S序列具有保守性，便于通用引物的設(shè)計、PCR擴(kuò)增和測序；④序列的組成、長度以及折疊方式存在多態(tài)性，可用于屬、種和種群水平的研究[27-28]。目前，應(yīng)用ITS1解決親緣關(guān)系較近的庫蠓分類以及系統(tǒng)關(guān)系的研究較多，如Mathieu等[29]通過設(shè)計ITS1-5.8S-ITS2 的TaqMan 探針對不顯庫蠓(Culicoidesobsoletus)和蘇格蘭庫蠓(Culicoidesscoticus)進(jìn)行雙重實(shí)時熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，Deblauwe等[30]通過設(shè)計ITS1的DNA微陣列形式的探針雜交對不顯庫蠓種群(Obsoletusgroup)的庫蠓進(jìn)行分子鑒定，說明ITS1是庫蠓種間和種內(nèi)遺傳分化程度及系統(tǒng)進(jìn)化研究的良好指標(biāo)。因此，基于庫蠓形態(tài)特征和rDNA-ITS1序列數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上對6種吸血蠓進(jìn)行鑒定和分析，其研究結(jié)果表明形態(tài)學(xué)特征與分子數(shù)據(jù)具有一致性，共同驗(yàn)證了rDNA-ITS1基因序列在吸血庫蠓(包括近似、近緣種)鑒別和系統(tǒng)發(fā)育研究中的適用性。

本研究rDNA-ITS1序列的堿基組成中A+T的平均含量(76.8%)遠(yuǎn)高于C+G的平均含量(33.2%)，具有AT偏向顯著。同時，該序列的變異位點(diǎn)(189個)較多，占比約為53.7%，且相對于線粒體基因(如COI和Cytb)其還存在較多的插入和缺失位點(diǎn)。Cêtre-Sossah等[31]利用ITS1序列對盛行于非洲和歐洲的藍(lán)舌病及非洲馬瘟病的主要傳播媒介庫蠓——?dú)埑釒祗稢.imicola進(jìn)行分子鑒定，通過設(shè)計特異引物可得到長度各不相同的ITS1擴(kuò)增產(chǎn)物，根據(jù)電泳條帶的位置即可進(jìn)行種類鑒別；同時，Gomulski等[32]利用rDNA-ITS2序列探究庫蠓亞屬及近緣種的系統(tǒng)發(fā)生，研究發(fā)現(xiàn)其存在明顯的多態(tài)性，表明絕大多數(shù)庫蠓的ITS序列存在多態(tài)性，而并非是由于PCR擴(kuò)增過程中產(chǎn)生的錯誤所致。

進(jìn)一步對庫蠓遺傳距離研究發(fā)現(xiàn)，各種間遺傳距離(0.113～0.621)明顯大于各種內(nèi)遺傳距離(0.000～0.020)，其中最大種內(nèi)遺傳距離(印度庫蠓C.indianus：0.020)亦小于最小種間遺傳距離(凹緣庫蠓C.holcus與連斑庫蠓C.jacobsoni：0.113)，進(jìn)一步說明庫蠓種間和種內(nèi)遺傳距離不存在重疊區(qū)，足以進(jìn)行準(zhǔn)確區(qū)分。同時，種間平均遺傳距離(0.411)為種內(nèi)平均遺傳距離(0.010)的41倍，也完全符合Hebert 等[33-34]提出的物種鑒定規(guī)則。因此，rDNA-ITS1基因可應(yīng)用于庫蠓的分子分類。然而，本研究中印度庫蠓C.indianus的種內(nèi)遺傳距離相對其他種類略大(0.020)，Matsumoto等[35]在基于ITS1和ITS2對25種庫蠓進(jìn)行研究的過程中發(fā)現(xiàn)印度庫蠓C.indianus存在ITS1長和短兩種序列類型，這可能就是造成本研究中其種內(nèi)遺傳距離偏大的原因。另外，關(guān)于昆蟲近緣種雜交的問題，Pesson等{36]在對白蛉亞科昆蟲進(jìn)行研究時發(fā)現(xiàn)其確實(shí)存在近緣物種雜交，但本研究中采自統(tǒng)一地點(diǎn)的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni并未發(fā)現(xiàn)任何基因滲透現(xiàn)象，這與Ritchie等[37]和Augot等[15]關(guān)于庫蠓的研究結(jié)果相一致。

此外，在對6種庫蠓的DNA序列聚類分析研究中發(fā)現(xiàn)，其與形態(tài)學(xué)鑒定和遺傳距離計算的結(jié)果基本相同，如凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni兩近似種同屬二囊亞屬，其形態(tài)學(xué)特征相似且種間遺傳距離(0.113)最小，在系統(tǒng)發(fā)育樹中優(yōu)先聚在一起構(gòu)成姊妹群。然而，來自日本的連斑庫蠓C.jacobsoni(AB462262.1)與我國廣西的種類首先分開，從拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上來看我國廣西的凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni聚為一支，但是從時間節(jié)點(diǎn)和分支長短來看同屬連斑庫蠓C.jacobsoni的種類具有更近的親緣關(guān)系。此外，構(gòu)建的NJ樹和ML樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)也基本一致，在種間和種內(nèi)的分支上均具較高的置信值，說明應(yīng)用rDNA-ITS1基因構(gòu)建的分子進(jìn)化樹能明顯區(qū)分庫蠓及其近似種，可靠程度較高。然而，荒川庫蠓C.arakawai和肩宏庫蠓C.humeralis的種內(nèi)存在置信值高低不等的差異，這與Gomulski 等[38]在基于同為核糖體DNA-ITS區(qū)的 ITS2序列對包括不顯庫蠓Culicoidesobsoletus在內(nèi)的二囊亞屬進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系的研究過程中的情況類似，究其原因可能主要是兩種建樹方法之間存在建樹理論基礎(chǔ)和建樹偏向性方面的差異。與此同時，在種內(nèi)個別分支上亦存在相對較低的置信值，如凹緣庫蠓C.holcus和連斑庫蠓C.jacobsoni之間的置信值僅為51，這與李瑋瑋[39]等對小蔗螟的研究以及秦芳[40]等對利川馬遺傳多態(tài)性的研究得到的結(jié)果相似，其可能是由于ITS1序列在堿基組成及變異速度方面存在差異以及ITS1序列片段短(352 bp，且存在插入和缺失位點(diǎn))和樣本數(shù)量少(n=23)等導(dǎo)致提供的有效分子遺傳學(xué)信息有限有關(guān)。

在廣泛使用ITS1等核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的基因序列進(jìn)行分析時，發(fā)現(xiàn)它存在基因的橫向轉(zhuǎn)移、重復(fù)以及外顯子拼接、域拼接等非線性的現(xiàn)象，說明其并非對所有物種都具有適用性[28]。同時，在核基因組研究中發(fā)現(xiàn)其存在線粒體假基因(NUMTs)的插入現(xiàn)象，這毋庸置疑是影響核基因的分子鑒定過程中準(zhǔn)確性的又一不利因素[41]。目前，蠓科學(xué)者在進(jìn)行庫蠓的系統(tǒng)發(fā)育分析時，不僅僅是從傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)角度進(jìn)行單因素的分析，同時還聯(lián)合線粒體基因、核基因，甚至是三維形態(tài)重建等多方面進(jìn)行綜合比對分析，如Augot等[15]聯(lián)合Cytb、CO I、ITS1和形態(tài)學(xué)特征可進(jìn)行翅痣庫蠓(Culicoidesstigma)和帕羅庫蠓(Culicoidesparroti)等近似種的準(zhǔn)確鑒別。同時，分類學(xué)家們也在不斷發(fā)掘新的分子標(biāo)記和分類技術(shù)，如CAD基因和幾何形態(tài)學(xué)等在庫蠓的分子系統(tǒng)學(xué)研究中的應(yīng)用[42-43]。因此，在后續(xù)的昆蟲分子系統(tǒng)學(xué)研究領(lǐng)域中的趨勢將是結(jié)合生態(tài)學(xué)、形態(tài)學(xué)特征和多個分子標(biāo)記數(shù)據(jù)等多重分類變量以及開發(fā)新分子標(biāo)記和分類技術(shù)來進(jìn)行更為全面、系統(tǒng)的分析。