， ，，， ，

沙門(mén)氏菌(Salmonella)是一種重要的人獸共患病原菌，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生方面均具有重要意義。該菌為兼性胞內(nèi)寄生菌，其致病性主要與基因組上成簇分布的編碼致病相關(guān)基因的特定區(qū)域—毒力島(Salmonellapathogenicity island，SPI)有關(guān)。目前在沙門(mén)氏菌基因組上發(fā)現(xiàn)了約39個(gè)SPI，分別以SPI-1～SPI-39表示，其中SPI-1和SPI-2與致病性密切相關(guān)[1-2]。有研究報(bào)道，位于SPI-1上hilD基因編碼的HilD在體外環(huán)境下，能對(duì)SPI-1的基因表達(dá)起調(diào)控作用，并且可以與位于SPI-2上的ssrAB啟動(dòng)子區(qū)域結(jié)合，誘導(dǎo)SPI-2上基因的表達(dá)，實(shí)現(xiàn)調(diào)控沙門(mén)氏菌SPI-1和SPI-2的作用[3-4]。然而，有關(guān)在體內(nèi)環(huán)境中HilD對(duì)ssrAB表達(dá)調(diào)控的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。

綠色熒光蛋白(green fluorescent protein, GFP)因具有無(wú)細(xì)胞毒性、熒光性質(zhì)穩(wěn)定、分子量小、操作簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，作為分子標(biāo)記被廣泛用于研究特定的環(huán)境下生物體的基因表達(dá)和蛋白定位監(jiān)控等[5-6]。本試驗(yàn)以鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)為研究對(duì)象，秀麗隱桿線蟲(chóng)為模式生物，通過(guò)同源重組技術(shù)將編碼綠色熒光蛋白的基因(gfp)插入pMD19-ssrAB質(zhì)粒中構(gòu)建pMD19-ssrAB-gfp重組質(zhì)粒，再轉(zhuǎn)入pWM91自殺質(zhì)粒中構(gòu)建pWM91-ssrAB-gfp重組自殺質(zhì)粒，最終分別轉(zhuǎn)入鼠傷寒沙門(mén)氏菌親本株空質(zhì)粒菌S.Typhi(pcDNA3.1)、hilD基因回補(bǔ)株S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)和hilD基因缺失株空質(zhì)粒菌S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1)中，經(jīng)含有100 g/mL鏈霉素-氨芐青霉素的雙抗LB瓊脂培養(yǎng)基上篩選鑒定后，獲得能夠穩(wěn)定表達(dá)GFP的標(biāo)記菌株。將構(gòu)建的帶有GFP分子的標(biāo)記菌株飼喂秀麗隱桿線蟲(chóng)，利用熒光顯微鏡觀察在線蟲(chóng)體內(nèi)標(biāo)記菌株GFP表達(dá)和綠色熒光強(qiáng)度及其在線蟲(chóng)體內(nèi)定殖和分布情況，初步探究體內(nèi)環(huán)境下HilD與ssrAB表達(dá)之間的相互關(guān)系，為深入探究沙門(mén)氏菌HilD介導(dǎo)ssrAB表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1菌株、質(zhì)粒和模式生物 鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium,S.Typhi)標(biāo)準(zhǔn)株CMCC50115購(gòu)自廣東省微生物研究所菌種保藏中心；親本株空質(zhì)粒菌S.Typhi(pcDNA3.1)、hilD基因回補(bǔ)株S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)及hilD基因缺失株空質(zhì)粒菌S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1)、pMD19-ssrAB重組質(zhì)粒均由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物傳染病實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存；pEGFP質(zhì)粒及pWM91自殺質(zhì)粒購(gòu)自TAKARA公司；大腸桿菌OP50(E.coliOP50)及秀麗隱桿線蟲(chóng)由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)李琳博士饋贈(zèng)。

1.2主要試劑和儀器 瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(TIANGEN公司)，M9培養(yǎng)基(上海羽朵生物科技有限公司)，S.Medium培養(yǎng)基(北京普博斯生物科技有限公司)，NGM瓊脂平板(英國(guó)OXIOD公司)，聚乙二醇辛基苯基醚Triton-X100(上海生工生物工程股份有限公司)，BamhI、HpaI、NotI、XhoI、T4 DNA連接酶均購(gòu)自于TAKARA生物科技有限公司。熒光顯微鏡(日本TOKYO公司)，Eon全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio Tek公司)。

1.3 GFP標(biāo)記菌株的構(gòu)建與表達(dá)

1.3.1GFP標(biāo)記菌株的構(gòu)建與鑒定 根據(jù)gfp基因序列(Gene ID:DQ399411.1)設(shè)計(jì)1對(duì)引物，酶切位點(diǎn)分別是BamhI和HpaI(下劃線標(biāo)出)，上游引物：5′-ATAGGATCCATGGTGAGCAAGGGCGA-GGA-3′；下游引物：5′-GCGGTTAACTTACTTGTACAGCTCGTCCA-3′，由南京金斯瑞生物公司合成。以pEGFP為模板，PCR擴(kuò)增得到約700 bpgfp片段。參考文獻(xiàn)[7-9]，用BamhI和HpaI分別雙酶切g(shù)fp片段和pMD19-ssrAB載體質(zhì)粒，按1∶4摩爾比混合，T4 DNA連接酶16 ℃連接12 h。連接產(chǎn)物pMD19-ssrAB-gfp和自殺質(zhì)粒pWM91分別用NotI和XhoI雙酶切，將ssrAB-gfp片段插入pWM91自殺質(zhì)粒中，提取質(zhì)粒DNA，PCR鑒定陽(yáng)性克隆，重組質(zhì)粒命名為pWM91-ssrAB-gfp。采用固相濾膜雜交法，分別將宿主菌S.Typhi(pcDNA3.1)、S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)和S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1)與pWM91-ssrAB-gfp進(jìn)行固相結(jié)合，涂布于100 g/mL鏈霉素-氨芐青霉素雙抗LB平板，挑取單克隆，經(jīng)菌液PCR和雙酶切初步鑒定后，送南京金斯瑞生物公司測(cè)序驗(yàn)證。

1.3.2GFP標(biāo)記菌株的表達(dá) 將S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)、S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)、S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1) 3株標(biāo)記菌分別接種5 mL含0.04%組氨酸的M9培養(yǎng)基，培養(yǎng)至菌液渾濁，置4 ℃冰箱3 d。分別將誘導(dǎo)表達(dá)的標(biāo)記菌離心后取沉淀，PBS洗滌3次，取10 μL涂于載玻片，石蠟封片，經(jīng)熒光顯微鏡觀察，同時(shí)以未轉(zhuǎn)入pWM91-ssrAB-gfp質(zhì)粒的S.Typhi(pcDNA3.1)為對(duì)照，確認(rèn)GFP表達(dá)與否。

1.4 標(biāo)記菌株在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的定殖觀察

1.4.1線蟲(chóng)同期化培養(yǎng) 參考文獻(xiàn)[10-11]，將含秀麗隱桿線蟲(chóng)蟲(chóng)卵的S.Medium培養(yǎng)基置20 ℃培養(yǎng)10 h，1 500 r/min離心 3 min，收集幼蟲(chóng)，轉(zhuǎn)至含E.coliOP50的 NGM平板，繼續(xù)培養(yǎng)48～60 h獲L4期幼蟲(chóng)。PBS洗下平板上線蟲(chóng)，洗滌3次收集幼蟲(chóng)，分裝于含2 mL S.Medium培養(yǎng)基的12孔板里(每孔大約15～20只蟲(chóng)體)，靜止培養(yǎng)過(guò)夜。

1.4.2標(biāo)記菌株前處理 將3株標(biāo)記菌分別接種5 mL LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜，以S.Typhi(pcDNA3.1)為對(duì)照組。分別取培養(yǎng)的標(biāo)記菌離心后收集沉淀，用S.Medium培養(yǎng)基洗滌2次并重懸菌體，測(cè)定標(biāo)記菌株OD600，調(diào)至所需濃度，備用。

1.4.3標(biāo)記菌株飼喂線蟲(chóng) 將同期化線蟲(chóng)分別涂于含3株標(biāo)記菌的NGM平板，以S.Typhi(pcDNA3.1)為對(duì)照組，20 ℃孵育10 h。

1.4.4線蟲(chóng)體內(nèi)GFP的顯微觀察 用PBS洗下NGM平板上線蟲(chóng)，清洗3次，分別放入含有1% Triton-X100的M9培養(yǎng)基，15 ℃培養(yǎng)2 h。PBS洗滌3次收集菌體，取5%瓊脂溶解后滴加于載玻片，立刻輕輕用蓋玻片壓平，形成約0.4 mm 厚的瓊脂圈，待瓊脂冷卻后，移去蓋玻片，滴加20 μL 10 mmol/L的NaN3于凝固的瓊脂圈上，取線蟲(chóng)置瓊脂圈的表面，待線蟲(chóng)定型后蓋上玻片，熒光顯微鏡下觀察標(biāo)記菌在線蟲(chóng)口咽部和腸道內(nèi)的分布情況。

1.4.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用ImegJ軟件對(duì)拍攝的熒光圖片半定量分析，并采用Prism軟件作圖。本研究統(tǒng)計(jì)分析均采用SPSS 19.0軟件分析，P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1GFP標(biāo)記菌株的構(gòu)建 將gfp基因克隆于pMD19-ssrAB重組質(zhì)粒載體上，PCR鑒定，由圖1-A可知，擴(kuò)增片段大小為2 081 bp(ssrAB-gfp)，與預(yù)期結(jié)果一致；提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD19-ssrAB-gfp雙酶切鑒定，由圖1-B及測(cè)序結(jié)果可知，雙酶切片段大小分別為2 081 bp(ssrAB-gfp)、2 692 bp(pMD19)，與預(yù)期結(jié)果一致；將ssrAB-gfp基因克隆于pWM91自殺質(zhì)粒載體上，提取陽(yáng)性重組質(zhì)粒pWM91-ssrAB-gfp雙酶切鑒定，由圖1-C及測(cè)序結(jié)果可知，雙酶切片段大小分別為2 081 bp(ssrAB-gfp)、8 423bp(pWM91)，與預(yù)期結(jié)果一致；通過(guò)固相結(jié)合方法，將ssrAB-gfp分別轉(zhuǎn)化到S.Typhi(pcDNA3.1)、S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1-hilD)和S.Typhi(ΔhilD+pcDNA3.1)中，由圖1-D及測(cè)序結(jié)果可知，擴(kuò)增片段大小2 081 bp(ssrAB-gfp)、274 bp(pcDNA3.1)、965bp(pcDNA3.1-hilD)，與預(yù)期結(jié)果一致。成功構(gòu)建了3株標(biāo)記菌S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)、S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)、S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)。

A：M: DNA Marker DL2000；1-2： ssrAB-gfp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；B：M: DNA Marker DL2000；1-2：pMD19-ssrAB-gfp雙酶切鑒定；C：M1: DNA Marker DL10000；M2: DNA Marker DL2000；1-2：pWM91-ssrAB-gfp雙酶切鑒定；D：M: DNA Marker DL2000；1-2：ssrAB-gfp基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；3-4：pcDNA3.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5-6： pcDNA3.1-hilD PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；圖1 PCR擴(kuò)增及重組質(zhì)粒酶切鑒定Fig.1 Amplification of PCR and the enzymes digestion of the recombinant plasmids

2.2標(biāo)記菌株GFP的熒光觀察 以未插入gfp基因的S.Typhi(pcDNA3.1)為對(duì)照，利用熒光顯微鏡觀察3株標(biāo)記菌中GFP的表達(dá)情況。對(duì)照組S.Typhi(pcDNA3.1)未見(jiàn)綠色熒光(圖2-A)，而3株標(biāo)記菌均可見(jiàn)綠色熒光(圖2-B、圖2-C、圖2-D)，顯示標(biāo)記菌已成功表達(dá)了外源GFP，且熒光強(qiáng)度存在明顯差異。由圖2-E可知，S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)的熒光強(qiáng)度顯著高于S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)(t=3.513，P<0.05)和S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)(t=6.722，P<0.05)，且S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)熒光強(qiáng)度高于S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1) (t=3.980，P<0.05)。

A：熒光顯微鏡下S.typhi(pcDNA3.1) 的表達(dá)；B：熒光顯微鏡下S.typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1) 的表達(dá)；C：熒光顯微鏡下S.typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD) 的表達(dá)；D：熒光顯微鏡下S.typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1) 的表達(dá) 圖2 GFP在標(biāo)記菌株中的表達(dá)差異Fig.2 Differences of expression of GFP in tagged strains

2.3標(biāo)記菌株在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)的定殖顯微觀察 將3株標(biāo)記菌和對(duì)照菌S.Typhi(pcDNA3.1)飼喂感染線蟲(chóng)，利用熒光顯微鏡觀察GFP在線蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)及分布情況。由圖3-A可知，對(duì)照組未見(jiàn)綠色熒光，但3株標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)可見(jiàn)分布不均的綠色熒光，主要分布在口咽部和腸道內(nèi)(圖3-B、圖3-C、圖3-D)，且熒光強(qiáng)度均為口咽部較腸道的高(tA=2.796；tB=2.785；tC=0.099,P<0.05，)(圖3-E)，顯示標(biāo)記菌可在線蟲(chóng)體內(nèi)定殖并成功表達(dá)GFP。通過(guò)ImegJ軟件比較綠色熒光強(qiáng)度，由圖3-F可以看出，3株標(biāo)記菌的熒光強(qiáng)度由強(qiáng)到弱依次為S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)>S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)>S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)。其中，S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)熒光強(qiáng)度顯著低于S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)(t=10.370,P<0.05)和S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)(t=8.477,P<0.05)，且S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)與S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)之間熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (t=3.554,P<0.05)。

1：口咽部；2：腸道A：線蟲(chóng)體內(nèi)S.typhi(pcDNA3.1)的表達(dá)；B：線蟲(chóng)體內(nèi)S.typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)的表達(dá)；C：線蟲(chóng)體內(nèi)S.typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)的表達(dá)；D：線蟲(chóng)體內(nèi)S.typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)的表達(dá)；E：標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)分布情況；F：標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)熒光強(qiáng)度對(duì)比圖3 標(biāo)記菌株在線蟲(chóng)體內(nèi)定殖情況Fig.3 Colonization of tagged strains in vivo of Caenorhabditis elegans

2.4標(biāo)記菌株在線蟲(chóng)體內(nèi)外環(huán)境下熒光強(qiáng)度比較通過(guò)ImegJ軟件比較3株標(biāo)記菌和對(duì)照菌的綠色熒光強(qiáng)度，由圖4可知，在線蟲(chóng)體內(nèi)和體外環(huán)境下，S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)與S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)之間熒光強(qiáng)度無(wú)明顯差異(tA=0.595；tB=0.719；P>0.05)，而S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)在體內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯弱于體外(t=7.091，P<0.05)。

圖4 3株標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)與體外的熒光強(qiáng)度比較Fig.4 Comparison of the fluorescence intensity of three tagged strains in vivo and in vitro of Caenorhabditis elegans

3 討 論

鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)屬于沙門(mén)氏菌屬B群，是一群宿主非特異性腸道致病菌，具有廣泛的宿主譜和致病性，能致各種動(dòng)物及人的副傷寒，常引起人類(lèi)食物中毒和其他疾病。近年來(lái)，該菌是世界各國(guó)分離率最高的沙門(mén)氏菌菌型之一[12-13]，在醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和公共衛(wèi)生方面的重要性均十分顯著。

目前，關(guān)于沙門(mén)氏菌毒力島調(diào)控的研究已經(jīng)成為探究該菌致病機(jī)理的重要方面。SPI-1和SPI-2是感染、侵襲、定殖于宿主的關(guān)鍵因子[14-17]。位于SPI-1上的調(diào)節(jié)子HilD不僅能調(diào)控SPI-1上基因表達(dá)，而且HilD可通過(guò)結(jié)合于SPI-2上ssrAB二元調(diào)控系統(tǒng)調(diào)節(jié)SPI-2上基因的表達(dá)。Martínez和Bustamante等研究發(fā)現(xiàn)體外環(huán)境下HilD調(diào)控SPI-2的機(jī)制與SPI-2上ssrAB基因啟動(dòng)子有關(guān)，HilD可結(jié)合到ssrAB的啟動(dòng)子上，招募OmpR蛋白，通過(guò)蛋白相互作用，將阻遏蛋白HS-N從ssrAB基因啟動(dòng)子上替換下來(lái)，使SPI-2上其他毒力基因得到表達(dá)。體外環(huán)境下HilD能夠介導(dǎo)ssrAB的表達(dá)[4,18]，但迄今尚未有文獻(xiàn)報(bào)道體內(nèi)環(huán)境中HilD對(duì)ssrAB表達(dá)的調(diào)控作用。

秀麗隱桿線蟲(chóng)因體小、通體透明、生長(zhǎng)周期短、基因組信息明確、實(shí)驗(yàn)室條件下易于培養(yǎng)及觀察等優(yōu)勢(shì)，而作為經(jīng)典的模式生物[19]。1994年Chalfie等首次報(bào)道以秀麗隱桿線蟲(chóng)為模型，通過(guò)觀察原核細(xì)胞或真核細(xì)胞中GFP的發(fā)光強(qiáng)弱，研究單個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)和蛋白定位[20]?，F(xiàn)已報(bào)道感染線蟲(chóng)的致病菌有沙門(mén)氏菌、銅綠假單胞菌、糞腸球菌等，其中鼠傷寒沙門(mén)氏菌是細(xì)菌中已發(fā)現(xiàn)的唯一感染秀麗隱桿線蟲(chóng)的胞內(nèi)菌[21-22]。

本試驗(yàn)首先成功構(gòu)建攜帶gfp基因的3株標(biāo)記菌S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)、S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)和S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)，以未攜帶gfp基因的S.Typhi(pcDNA3.1) 菌株為對(duì)照，通過(guò)熒光顯微鏡觀察到3株標(biāo)記菌均呈現(xiàn)綠色熒光，對(duì)照菌則無(wú)熒光，表明外源GFP在標(biāo)記菌中得到表達(dá)。繼而重要的是將上述3株標(biāo)記菌和對(duì)照菌飼喂感染秀麗隱桿線蟲(chóng)后，以熒光顯微鏡仍可直接觀察到3株標(biāo)記菌的綠色熒光，而對(duì)照菌無(wú)熒光，表明攜帶gfp基因的標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)也獲得了GFP的表達(dá)。ImegJ軟件半定量測(cè)定的結(jié)果顯示，標(biāo)記菌的綠色熒光強(qiáng)度存在差異。在體外環(huán)境下，雖然S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)的熒光顯著強(qiáng)于S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)(P<0.05)，這可能由于hilD基因缺失株回復(fù)時(shí)轉(zhuǎn)入了hilD基因過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，使HilD表達(dá)量下降，進(jìn)而引起ssrAB表達(dá)水平低[23-24]；但S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)與S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)和S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD) 之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)呈現(xiàn)了同樣情況，S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)的熒光顯著強(qiáng)于S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)(P<0.05)及S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)(P<0.05)，且S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)與S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD) 之間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。不僅證實(shí)了體外環(huán)境下鼠傷寒沙門(mén)氏菌HilD正調(diào)控ssrAB，也表明了體內(nèi)環(huán)境中HilD對(duì)ssrAB的調(diào)控具有相同作用。然而HilD并非單一介導(dǎo)ssrAB的表達(dá)調(diào)控，尚存在其他調(diào)控因子的參與。有研究表明，體外環(huán)境下ssrAB的表達(dá)既受HilD的調(diào)控，又能夠通過(guò)EnvZ/OmpR、PhoP/Q雙組份系統(tǒng)以及轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子SlyA等參與調(diào)控[25-28]。由此推斷在體內(nèi)環(huán)境中，HilD介導(dǎo)ssrAB表達(dá)的調(diào)控機(jī)制可能與體外環(huán)境下的相似。

比較標(biāo)記菌株在秀麗隱桿線蟲(chóng)體內(nèi)外的綠色熒光強(qiáng)度，S.Typhi(ssrAB-gfp+pcDNA3.1)與S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1-hilD)之間無(wú)明顯差異，但S.Typhi(ΔhilD+ssrAB-gfp+pcDNA3.1)在線蟲(chóng)體內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯弱于體外，其原因可能是：①標(biāo)記菌株gfp-ssrAB在線蟲(chóng)體內(nèi)的表達(dá)量較低；②在不同生長(zhǎng)條件下，沙門(mén)氏菌的HilD表達(dá)水平存在顯著差異，從而導(dǎo)致ssrAB表達(dá)量的變化[29-30]；③HilD與宿主間的相互作用也可能影響其對(duì)ssrAB表達(dá)的調(diào)控，López-Garrido證實(shí)hilD基因的mRNA的3′端未翻譯區(qū)存在一些符合真核生物的特征序列，預(yù)測(cè)宿主體內(nèi)的某些基因可能影響了hilD對(duì)ssrAB表達(dá)的調(diào)控[31]。此外，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，3株標(biāo)記菌在線蟲(chóng)體內(nèi)分布不均，主要定殖在口咽部和腸道中，且其熒光強(qiáng)度為口咽部較腸道高，這可能與線蟲(chóng)口咽部和腸道的結(jié)構(gòu)及其分泌的效應(yīng)因子有關(guān)。Sulston[32]發(fā)現(xiàn)線蟲(chóng)的口咽部是由20個(gè)肌肉細(xì)胞、20個(gè)神經(jīng)細(xì)胞和18個(gè)上皮細(xì)胞形成的3條輻射狀結(jié)構(gòu)，腸道則是由20個(gè)上皮細(xì)胞組成的簡(jiǎn)單線性結(jié)構(gòu)，口咽部黏膜面積大于腸道黏膜面積，有利于標(biāo)記菌在該處定殖。Berman[33]研究表明線蟲(chóng)表達(dá)的抗菌肽ABF在口咽部和腸道中均能發(fā)揮抑菌活性，同時(shí)腸道分泌的3種溶菌酶lys-1、lys-7、lys-8也具有殺菌作用，能夠有效抑制標(biāo)記菌在其內(nèi)定殖。由此也可初步推斷出鼠傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)秀麗隱桿線蟲(chóng)的侵染路線。

本試驗(yàn)成功在鼠傷寒沙門(mén)氏菌中穩(wěn)定表達(dá)了gfp基因，利用秀麗隱桿線蟲(chóng)作為模式生物，使GFP在其口咽部和腸道的黏膜表面得到表達(dá)，首次進(jìn)行了體內(nèi)環(huán)境中HilD介導(dǎo)ssrAB表達(dá)的初探，為進(jìn)一步開(kāi)展HilD與ssrAB基因結(jié)合位點(diǎn)的確立，深入探究沙門(mén)氏菌HilD介導(dǎo)ssrAB表達(dá)調(diào)控奠定基礎(chǔ)。