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變異鏈球菌(Streptococcusmutans，S.mutans)是草綠色鏈球菌的一種，革蘭氏陽性球菌，兼性厭氧，是人類齲病的主要致病菌，可引起牙髓病、牙周病、頜骨炎，感染性心內(nèi)膜炎等一系列并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的身心健康和生活質(zhì)量[1-3]。變異鏈球菌在人類口腔中生存的酸堿度、溫度、氧分壓、滲透壓等環(huán)境極易受到人類日?；顒拥挠绊懀稍诳谇恢虚L期存活并不斷繁殖，變異鏈球菌通過改變其蛋白質(zhì)的表達(dá)狀態(tài)(包括蛋白質(zhì)的種類和表達(dá)的量)，以消除外界變化對菌體造成的影響[3]。然而，正是這種對環(huán)境改變的應(yīng)對機(jī)制使得菌體內(nèi)一些小分子蛋白質(zhì)迅速聚集，多為瞬時表達(dá)和受應(yīng)激因素刺激而發(fā)生損傷的蛋白質(zhì)分子，這些蛋白質(zhì)大多不但不能行駛應(yīng)有的生物學(xué)功能，如不及時清除還會對細(xì)菌造成致命的損傷[4-6]。因此，及時清除迅速聚集的小分子蛋白質(zhì)和維持細(xì)菌內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)(homeostasis)成為變異鏈球菌生存并成為齲損部位的優(yōu)勢菌以及致病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。我們前期研究證實(shí)變異鏈球菌ClpP蛋白酶在清除應(yīng)激相關(guān)蛋白質(zhì)和損傷的蛋白質(zhì)、維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用[4-5]。然而變異鏈球菌clpP基因在對外應(yīng)激耐受中以何種方式被誘導(dǎo)及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制的報道尚不多見，為此本文通過構(gòu)建變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其突變體β-半乳糖苷酶 (β-glucuronidase,gusA)報道基因表達(dá)載體及其表達(dá)株，以研究變異鏈球菌clpP基因啟動子生物活性及其結(jié)構(gòu)，為闡明變異鏈球菌clpP基因表達(dá)調(diào)控的機(jī)制奠定理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1菌株及質(zhì)粒 大腸桿菌Top 10、變異鏈球菌UA159為本室保存。pIB107質(zhì)粒由堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Indrainl Biswas教授惠贈，含有松鼠葡萄球菌ami基因啟動子的gusA報道基因表達(dá)載體pFami132由本室構(gòu)建保存。

1.1.2試劑 細(xì)菌基因組提取試劑盒及小量質(zhì)粒提取試劑盒為天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品，DNA marker、TaqDNA 聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4DNA 連接酶均為TaKaRa (大連)公司產(chǎn)品；QIAquick PCR Purification Kit為Qiagen公司產(chǎn)品； p-nitrophenyl-β-D-glucoside (PNPG)為Sigma公司產(chǎn)品；余為國產(chǎn)或進(jìn)口分析純試劑。

1.2 方法

1.2.1變異鏈球菌UA159基因組DNA的提取 離心收集處于對數(shù)生長期的變異鏈球菌UA159，滅菌0.1 mol/L PBS(pH7.4)洗滌3次，按照細(xì)菌基因提取試劑盒說明書提取變異鏈球菌UA159的基因組DNA。

1.2.2序列片段擴(kuò)增 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的擴(kuò)增 在0.2 mL PCR反應(yīng)管中建立如下反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 5 μL，dNTPs(10 mmol/L)1 μL，MgCl2(25 mmol/L)4 μL，TaqDNA聚合酶0.5 μL， 變異鏈球菌UA159基因組DNA 50 ng，上、下游引物各10 nmoL，加滅菌水至50 μL；反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性45 s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列片段(FclpP)及其突變體片段(FclpP-ΔRS)擴(kuò)增、后續(xù)PCR鑒定和測序所用的引物見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)采用的引物序列及用途Tab.1 Primers used in this study and purposes

aRestriction sites used to facilitate ligation are underlined and italic.
bRS，repeat sequence.

1.2.3變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其突變體gusA報道基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)QIAquick PCR Purification Kit純化后，限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI酶切，與經(jīng)BamHI/XhoI酶切的gusA報道基因表達(dá)載體pIB107連接，轉(zhuǎn)化E.coliTop 10，氨芐西林(100 g/mL)和卡那霉素(50 g/mL)篩選，PCR及酶切鑒定陽性克隆，構(gòu)建clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的gusA報道基因表達(dá)載體，分別命名為pFclpP和pFclpP-ΔRS，并交由上海立菲生物工程有限公司測序。PCR及測序所用引物為Smu1405-FGus-R2，詳見表1。

1.2.4變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其突變體gusA報道基因表達(dá)株的構(gòu)建及GusA活性測定 將含有clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的gusA報道基因表達(dá)載體pFclpP和pFclpP-ΔRS、含有松鼠葡萄球菌ami基因啟動子的陽性對照質(zhì)粒pFami132及不含啟動子的gusA報道基因表達(dá)載體pIB107經(jīng)BglII線性化后，分別轉(zhuǎn)化變異鏈球菌UA159，卡那霉素(300 g/mL)篩選，構(gòu)建各待測片段gusA報道基因表達(dá)株，分別命名為SClpP、SClpP-ΔRS、SAmi(陽性對照)和SIB107(陰性對照)，經(jīng)PCR及測序驗(yàn)證后，參照文獻(xiàn)[6]測定各待測片段gusA報道基因表達(dá)株的GusA活性，鑒定變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS啟動子活性。PCR及測序所用引物分別為BamHI-clpP-F1Gus-R2和BamHI-clpP-F2Gus-R2，序列見表1。

2 結(jié) 果

2.1變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其截短突變體FclpP-ΔRS的體外擴(kuò)增 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示：分別在621 bp及271 bp處有特異性明亮擴(kuò)增帶，相對分子量大小與預(yù)期結(jié)果一致，且未見非特異擴(kuò)增帶，詳見圖1。

M: DNA Marker 20001: 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列截短突變體(FclpP-ΔRS)PCR擴(kuò)增結(jié)果；2: 陰性對照；3: 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列(FclpP)PCR擴(kuò)增結(jié)果；4: 陰性對照圖1 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其截短突變體的PCR擴(kuò)增結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of 5′-flanking sequence and its shortened mutants of S.mutans clpP gene amplified by PCR

2.2變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其突變體gusA報道基因表達(dá)載體的構(gòu)建與鑒定 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS經(jīng)BamHI/XhoI酶切，插入到的pIB107載體，得到clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的gusA報告基因表達(dá)載體pFclpP和pFclpP-ΔRS。提取質(zhì)粒，行PCR及酶切鑒定，產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示插入片段和載體片段相對分子量大小正確。測序結(jié)果進(jìn)一步證明成功構(gòu)建了變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的gusA報道基因表達(dá)載體，詳見圖2。

M1: DNA Marker 1kb Ladder；M2: DNA Marker 20001: pFclpP-ΔRS質(zhì)粒PCR鑒定；2: pFclpP質(zhì)粒PCR鑒定；3: pFclpP質(zhì)粒BamHI / XhoI雙酶切鑒定；4: pFclpP質(zhì)粒BamHI / XhoI雙酶切鑒定圖2 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其截短突變體gusA報道基因表達(dá)載體的鑒定Fig.2 Identification of the gusA report plasmids of 5′-flanking sequence and its shortened mutants of S.mutans clpP gene

2.3變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其突變體gusA報道基因表達(dá)株的鑒定 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS的gusA報道基因表達(dá)載體pFclpP和pFclpP-ΔRS，連同陰性對照空載體pIB107及含有松鼠葡萄球菌ami基因啟動序列的陽性對照pFami132質(zhì)粒經(jīng)線性化后轉(zhuǎn)化變異鏈球菌UA159，經(jīng)卡那霉素篩選，挑選陽性轉(zhuǎn)化子行菌落PCR鑒定，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示在1 341 bp和991 bp處有特異性明亮擴(kuò)增帶，與預(yù)期結(jié)果相符，詳見圖3。測序證實(shí)變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP或其突變體FclpP-ΔRS及gusA報道基因-kanR抗性基因盒以單拷貝插入變異鏈球菌轉(zhuǎn)座酶基因(SMU.1405)中。

1: 轉(zhuǎn)化線性化pIB107質(zhì)粒的gusA報道基因表達(dá)株的PCR擴(kuò)增結(jié)果；2: 轉(zhuǎn)化線性化pFclpP質(zhì)粒的gusA報道基因表達(dá)株的PCR擴(kuò)增結(jié)果；3: 轉(zhuǎn)化線性化pFclpP-ΔRS的 質(zhì)粒gusA報道基因表達(dá)株P(guān)CR擴(kuò)增結(jié)果 M: DNA Marker 2000圖3 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其截短突變體gusA報道基因表達(dá)株的PCR鑒定Fig.3 PCR products of the gusA report strains of 5′-flanking sequence and its shortened mutants of S.mutans clpP gene

2.4變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其截短突變體啟動子活性 GusA活性測定結(jié)果表明變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列g(shù)usA報道基因表達(dá)株SClpP的GusA活性是陰性對照不含啟動子的gusA報道基因表達(dá)株SIB107的34.6倍之多，是陽性對照松鼠葡萄球菌ami基因啟動子片段gusA報道基因表達(dá)株SAmi的8.7倍左右；clpP基因5′-側(cè)翼序列突變體gusA報道基因表達(dá)株SClpP-ΔRS的啟動子活性是陰性對照的5.2倍，是陽性對照的1.3倍，說明插入片段變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP及其突變體FclpP-ΔRS具有較強(qiáng)的啟動子活性。詳見圖4所示。

SClpP: 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列g(shù)usA報道基因表達(dá)株；SClpP-ΔRS: 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列截短突變體gusA報道基因表達(dá)株；SAmi: 陽性對照 SIB107: 陰性對照圖4 變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列及其截短突變體GusA活性測定Fig.4 GusA activity analysis of the gusA report strains of S.mutans clpP gene 5′-flanking sequence and its shortened mutants

3 討 論

課題組前期對變異鏈球菌基因組結(jié)構(gòu)研究表明，變異鏈球菌clpP基因上游為upp基因，編碼尿嘧啶磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶，其轉(zhuǎn)錄方向與clpP基因相同，兩者之間存在一非編碼區(qū)；而對clpP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)變異鏈球菌UA159株clpP基因存在1.9 kb和0.67 kb兩種轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，兩者在菌體存在的時間均小于1 min；其中0.67 kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的含量占總表達(dá)產(chǎn)物的80%，為clpP基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，而1.9 kb轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物占20%，為clpP基因及其上游upp基因共轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物[6]。因此，我們推斷在變異鏈球菌clpP基因與其上游upp基因之間的非編碼區(qū)存在著clpP基因的啟動子。為檢測變異鏈球菌clpP基因與upp基因之間的非編碼區(qū)是否具有啟動子活性，我們將clpP基因與upp基因之間的非編碼區(qū)及upp基因3′-端部分DNA片段插入到gusA報道基因表達(dá)載體pIB107的gusA報道基因的上游，構(gòu)建變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列g(shù)usA報道基因表達(dá)載體。

pIB107載體由堪薩斯大學(xué)醫(yī)學(xué)中心的Indrainl Biswas教授為研究變異鏈球菌啟動子活性而特地構(gòu)建的，其BamHI/XhoI酶切位點(diǎn)上游無啟動子序列和表達(dá)調(diào)控元件，下游即為gusA報道基因，編碼β-半乳糖苷酶 (β-glucuronidase, GusA)，能夠水解PNPG生成淡黃色的對硝基苯胺，在420～450 nm處具有高的消光系數(shù)，可由分光光度計測定[7]。因此可通過檢測GusA活性間接反映上游插入片段的啟動子活性。GusA活性測定較lacZ(β-半乳糖苷酶基因)、cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)、lux(熒光素酶基因)等目前常用的測定啟動子活性的方法具有背景低、靈敏度高，線性范圍廣、設(shè)備要求低、操作簡單、快速等優(yōu)點(diǎn)。pIB107載體的gusA報道基因的下游為kanR抗性基因盒，而變異鏈球菌轉(zhuǎn)座酶基因(SMU.1405)5′-端及3′-端約700～900 bp的基因片段分別位于gusA報道基因的上游和kanR抗性基因盒的下游。因此線性化的載體可以借由此兩同源臂與變異鏈球菌SMU.1405基因發(fā)生同源重組，使插入兩同源臂中的插入序列以單拷貝的形式插入變異鏈球菌SMU.1405中，這不僅消除了載體拷貝數(shù)不同對GusA活性測定造成的影響，同時不會影響宿主菌其他基因和生物學(xué)功能，還便于重組子的篩選[8]。這種序列特異性同源重組多用于序列的定向插入或缺失，具有DNA序列不丟失、不合成等優(yōu)點(diǎn)，是生命科學(xué)中常用的分子生物學(xué)方法和手段。

Jiaqin Zhang等[6]對變異鏈球菌clpP基因及其周圍DNA進(jìn)行序列和結(jié)構(gòu)分析，分析結(jié)果顯示，在clpP基因翻譯起始位點(diǎn)上游292 bp處，有7個隨機(jī)串聯(lián)重復(fù)序列，其重復(fù)基序由49～50 bp的堿基組成GCGAGGCTANAGTCCAGTGGACTGT TATTTCCCGAGCTNTNAAAATNGATN。其中每個基序由一個及其保守29 bp堿基組成的核心區(qū)域，核心區(qū)域的3′及5′-側(cè)翼序列僅有個別堿基不同。諸多研究已證實(shí)細(xì)菌的重復(fù)序列多為非編碼序列，通常具有順式作用元件的作用，對基因表達(dá)、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、乃至染色體的構(gòu)建以及生理代謝都起著不可或缺的作用，為初步探討此串聯(lián)重復(fù)序列的功能，我們構(gòu)建了變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列突變體gusA報道基因表達(dá)株SClpP-ΔRS，在該突變體中我們將串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行了缺失突變。GusA活性測定表明變異鏈球菌clpP基因5′-側(cè)翼序列FclpP具有較強(qiáng)的啟動子活性，是陽性對照松鼠葡萄球菌ami基因啟動子片段活性的8.7倍，說明插入片段具有較強(qiáng)的啟動子活性，而clpP基因5′-側(cè)翼序列突變體FclpP-ΔRS的啟動子活性是陽性對照松鼠葡萄球菌ami基因啟動子片段的1.3倍，因此我們推斷clpP基因上游的串聯(lián)重復(fù)序列具有增強(qiáng)clpP基因表達(dá)的功能，其作用機(jī)制尚待實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)。

綜述之，本實(shí)驗(yàn)成功克隆了變異鏈球菌clpP基因啟動子，GusA活性測定證實(shí)具有較強(qiáng)的啟動子活性，同時對變異鏈球菌clpP基因串聯(lián)重復(fù)序列進(jìn)行了初步的功能驗(yàn)證，為后續(xù)clpP基因啟動子的結(jié)構(gòu)及其表達(dá)調(diào)控機(jī)制的研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和方法上的借鑒。