曾宇鵬 謝席勝

1閬中市人民醫(yī)院腎內(nèi)科（四川閬中637400）；2南充市中心醫(yī)院腎內(nèi)科（四川南充637000）

慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）近年來(lái)發(fā)病率逐漸升高，嚴(yán)重威脅人們生命健康。CKD 具有患病率高、合并心血管疾病率高和病死率高的“三高”特點(diǎn)，以及知曉率低、防治率低和合并心血管疾病認(rèn)知率低的“三低”特點(diǎn)［1］。我國(guó)CKD 總患病率達(dá)10.8%，CKD 患者預(yù)計(jì)近1.2 億，但CKD 知曉率僅為12.5%，CKD 患者最終進(jìn)展為終末期腎?。╡nd-stage renal disease，ESRD），患者需終生透析治療或者腎替代治療。腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是導(dǎo)致CKD 進(jìn)展為ESRD 的主要病理改變。正常情況下，腎小管上皮細(xì)胞通過(guò)自身增殖、再生等機(jī)制自我修復(fù)腎小管損傷，并能夠通過(guò)凋亡機(jī)制清除自身老化、壞死細(xì)胞，維持腎小管正常生理功能。然而病理?xiàng)l件下，腎小管上皮細(xì)胞過(guò)度凋亡損傷腎組織結(jié)構(gòu)和正常功能，是導(dǎo)致RIF 進(jìn)展的重要機(jī)制之一。

尿酸（uric acid，UA）是嘌呤代謝的終末產(chǎn)物，嘌呤代謝紊亂、能量代謝異常及腎臟對(duì)尿酸的排泄障礙均可引起血漿尿酸濃度升高或降低。腎臟是尿酸代謝的主要器官，體內(nèi)尿酸70%由腎臟排泄［3］。既往研究發(fā)現(xiàn)高尿酸通過(guò)線(xiàn)粒體途徑導(dǎo)致人腎小管上皮細(xì)胞（human renal tubular epithelial cells，HK-2）凋亡，高尿酸血癥是導(dǎo)致CKD 進(jìn)展的重要因素［4］，此外高尿酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)HK-2 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化［5］，本研究重點(diǎn)探討尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，尿酸激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能是其重要分子機(jī)制，為治療高尿酸腎損害提供了新的線(xiàn)索。

1 材料與方法

1.1 材料 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 購(gòu)買(mǎi)自美國(guó)ATCC 細(xì)胞庫(kù)；DMED 培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司，胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司；尿酸和四甲基偶氮唑鹽（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；4-苯基丁酸（4-PBA）購(gòu)自美國(guó)Sigma-Aldrich 公司；Annexin V-FITC∕碘化丙啶雙標(biāo)記細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京華夏遠(yuǎn)洋科技有限公司；兔抗人Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3、Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12、BiP∕GRP78 抗體購(gòu)自美國(guó)CST 公司；兔抗人IRE-1 和JNK 單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)abcam 公司；β-ACTIN抗體購(gòu)自沈陽(yáng)萬(wàn)類(lèi)生物科技有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人腎小管上皮細(xì)胞HK-2 接種于含10%胎牛血清和雙抗溶液（青霉素100 IU∕mL 和鏈霉素100 IU∕mL）的DMEM 培養(yǎng)基中，細(xì)胞呈貼壁生長(zhǎng)，放置在37 ℃、含5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，每隔2～3 d 細(xì)胞換液。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期時(shí)，用0.05%胰酶消化離心并重懸細(xì)胞，傳代于新培養(yǎng)皿繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 四甲基偶氮唑藍(lán)（MTT）實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的HK-2 細(xì)胞按照5 000 個(gè)∕孔接種于96 孔板，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔，37 ℃、5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，分別加入0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24、48、72 h，處理后每孔加入含MTT 培養(yǎng)基200 μL，培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育4 h。吸去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL DMSO，振蕩器低速振蕩10 min。待結(jié)晶物充分溶解，使用酶標(biāo)儀490 nm 處檢測(cè)各孔吸光度（OD值）。

1.4 免疫印跡法（Western blot）檢測(cè)蛋白水平 將HK-2 細(xì)胞消化離心后種于6 孔板內(nèi)，待細(xì)胞貼壁后，加入不同濃度的尿酸分組繼續(xù)培養(yǎng)24 h。PBS清洗細(xì)胞3 遍，使用RIPA 裂解液裂解，提取總蛋白。采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度，其余蛋白加入6×Loading buffer 加熱變性。取變性后蛋白20 μg ∕孔加入SDS-PAGE 凝膠電泳分離，110 V 電壓轉(zhuǎn)移至NC膜上。5%脫脂奶粉封閉1 h，TBST洗3次，每次10 min。加特定一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日TBST 清洗10 min × 3 次，加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，于搖床上慢速常溫孵育1 h，TBST清洗10 min× 3 次，加入ECL 顯影液，使用化學(xué)發(fā)光熒光成像系統(tǒng)（Bio-Rad）進(jìn)行蛋白顯影。以β-actin 作為內(nèi)參計(jì)算各組蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 HK-2 細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)，調(diào)整細(xì)胞密度按4.0 × 105∕孔接種于6孔板中，細(xì)胞培養(yǎng)至貼壁，加入150 和200 mg∕L 的尿酸分別處理HK-2 細(xì)胞24 h。PBS 清洗細(xì)胞后加入胰酶消化離心，再次使用PBS 清洗2 次，每管加入250 μL 結(jié)合緩沖液，細(xì)胞計(jì)數(shù)后調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度為1.0 × 106∕mL，吸取100 μL 細(xì)胞懸液加入流式管，加入Annexin V-FITC（150 mg∕L）和碘化丙錠（120 mg∕L）混勻，放置于避光、室溫條件下孵育15 min，加入PBS清洗細(xì)胞，使用流式細(xì)胞儀（FACS）檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)結(jié)果使用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所得的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），P＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖能力 使用0、50、100、150、200、250、300 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h（圖1A），以及150 mg∕L 的尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24、48、72 h（圖1B），使用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)腎小管上皮細(xì)胞增殖能力的變化，結(jié)果顯示與對(duì)照組相比尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖能力，并呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.2 尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá) 實(shí)驗(yàn)組150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，通過(guò)Western blot檢 測(cè)Caspase-3∕Cleaved-Caspase-3 和Caspase-12∕Cleaved-Caspase-12 蛋白改變，與對(duì)照組相比尿酸促進(jìn)HK-2 細(xì)胞（圖2A 和圖2B）Cleaved-Caspase 3和Cleaved-Caspase 12 蛋白表達(dá)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 尿酸促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞凋亡 使用150 和200 mg∕L 濃度尿酸處理HK-2 細(xì)胞24 h，Annexin VFITC∕PI 雙染流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞凋亡。對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為（5.12±1.02）%，150和200 mg∕L 尿酸處理組細(xì)胞凋亡率分別為（23.69±3.62）%和（38.87±5.48）%（表1）。與對(duì)照組相比，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖Fig.1 Uric acid inhibits the proliferation of renal tubular epithelial cells

2.4 尿酸通過(guò)IRE-1/JNK 信號(hào)通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡 本研究發(fā)現(xiàn)尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡發(fā)生，但其分子機(jī)制未知。文獻(xiàn)［6］報(bào)道細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與增殖和凋亡存在密切聯(lián)系，本研究繼續(xù)探究尿酸和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)組150 mg∕L和200 mg∕L 濃度尿酸處理腎小管上皮細(xì)胞24 h，Western-blot 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細(xì)胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達(dá)上調(diào)（圖3A），說(shuō)明尿酸激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的發(fā)生。應(yīng)用4-PBA（5 μmol∕L）阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后合用尿酸處理，與尿酸處理組（200 mg∕L）相比Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調(diào)（圖3B），同時(shí)MTT實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞存活率升高（P= 0.004）（圖3C），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。顯示4-PBA 能夠抑制尿酸引起的腎小管上皮細(xì)胞凋亡，尿酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮功能。

3 討論

尿酸是人體嘌呤代謝的產(chǎn)物，作為人體重要小分子由腎臟排出，流行病學(xué)發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期高尿酸血癥是引起慢性腎臟病的重要因素［7］。隨著人們攝入富含嘌呤類(lèi)或者蛋白質(zhì)類(lèi)食物的增加，高尿酸血癥發(fā)病率呈逐年升高［8］。高尿酸形成結(jié)晶沉積在腎小管-腎間質(zhì)中，通過(guò)誘發(fā)機(jī)械性損傷或者炎癥反應(yīng)導(dǎo)致腎功能損害［9］。

圖2 尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá)Fig.2 Uric acid promotes the protein expression of Cleaved-Caspase-3 and Cleaved-Caspase-12

表1 尿酸對(duì)腎小管上皮細(xì)胞凋亡率的影響Tab.1 Effect of uric acid on apoptosis rate of renal tubular epithelial cells ±s

注：與對(duì)照組相比，*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001

分組對(duì)照組150（mg∕L）尿酸200（mg∕L）尿酸凋亡率（%）5.12±1.02 23.69±3.62 38.87±5.48 P 值0.001**＜0.001***

圖3 尿酸通過(guò)IRE-1∕JNK 信號(hào)通路激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡Fig.3 Uric acid activates endoplasmic reticulum stress through IRE-1∕JNK signaling pathway to regulate cell proliferation and apoptosis

腎小管上皮細(xì)胞富含尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)體，是尿酸代謝過(guò)程中的重要組成。腎小管上皮細(xì)胞凋亡增多是導(dǎo)致尿酸轉(zhuǎn)運(yùn)障礙的重要因素［10］，本研究重點(diǎn)探討尿酸對(duì)腎小管上皮細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響。不同濃度尿酸或者不同時(shí)間處理腎小管上皮細(xì)胞，MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力發(fā)現(xiàn)尿酸抑制其增殖，且呈濃度依賴(lài)性和時(shí)間依賴(lài)性。同時(shí)使用Western blot 檢測(cè)不同濃度尿酸處理后凋亡蛋白水平改變，尿酸促進(jìn)Cleaved-Caspase-3 和Cleaved-Caspase-12 蛋白表達(dá)。此外，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)尿酸處理后腎小管上皮細(xì)胞凋亡水平，發(fā)現(xiàn)尿酸促進(jìn)其凋亡。高尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，既往文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)尿酸可激活線(xiàn)粒體途徑導(dǎo)致HK-2 細(xì)胞凋亡，加速腎臟病惡性進(jìn)展，然而高尿酸引起HK-2 細(xì)胞凋亡的其他分子機(jī)制尚不清楚。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmic reticulum，ER）在真核生物中普遍存在，其內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定是維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)正常生理功能的基本條件，但很多因素可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能失衡，形成內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ER stress，ERs），例如缺血再灌注損傷、氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)過(guò)度錯(cuò)誤折疊、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣代謝紊亂等［11］。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白GRP78∕BiP 和IRE1 是ERs 過(guò)程中重要分子，生理?xiàng)l件下兩者結(jié)合而失活，而ERs 發(fā)生時(shí)兩者分離而激活下游信號(hào)通路［12］。當(dāng)ERs 長(zhǎng)期存在時(shí)，會(huì)引起細(xì)胞凋亡。IRE1 是介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵分子，通過(guò)與合腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TNF receptor associated factor，TRAF2）和凋亡信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（apoptosis-signaling kinase 1，ASK1）結(jié)合形成TRAF2-ASK1-JNK 復(fù)合體，激活下游JNK 信號(hào)通路引起細(xì)胞凋亡［17］。本研究通過(guò)Western-blot 檢測(cè)不同濃度尿酸處理后腎小管上皮細(xì)胞BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白改變，發(fā)現(xiàn)BiP∕GRP78、IRE1 和JNK 蛋白表達(dá)升高，說(shuō)明尿酸激活腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。然而尿酸是否通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激調(diào)節(jié)增殖和凋亡卻不能確定，本實(shí)驗(yàn)使用4-PBA 阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激后再使用尿酸處理，發(fā)現(xiàn)Cleaved-Caspase-12 蛋白水平下調(diào)，同時(shí)細(xì)胞存活率升高，證實(shí)了尿酸通過(guò)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑發(fā)揮功能。

綜上所述，尿酸抑制腎小管上皮細(xì)胞增殖并促進(jìn)其凋亡，并發(fā)現(xiàn)尿酸通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是其可能的分子機(jī)制，阻斷內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激治療高尿酸血癥引起的慢性腎臟病具有臨床應(yīng)用價(jià)值，進(jìn)一步深入探討尿酸損傷腎小管上皮細(xì)胞的分子機(jī)制，將有可能為高尿酸血癥的綜合治療帶來(lái)新的選擇。