潘建華，石國民，馬小華，向延根

(長沙市中心醫(yī)院檢驗科，湖南長沙 410004)

WHO 2016年結(jié)核病報告指出，我國結(jié)核病患者數(shù)量居世界第3位，是世界上30個結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一[1]。據(jù)WHO估算，中國每年新發(fā)結(jié)核病患者數(shù)量多達(dá)900 000例，每年新發(fā)耐多藥結(jié)核病患者70 000例。耐藥結(jié)核分枝桿菌(MTB)的傳播是防控結(jié)核病的主要威脅之一，治療每例耐多藥結(jié)核患者的費(fèi)用是治療藥物敏感患者費(fèi)用的20倍。快速檢測MTB及其耐藥性可精準(zhǔn)治療患者，縮短病程，減輕患者痛苦，有效降低耐藥菌株的傳播。為了解本院MTB的耐藥基因ropB、KatG和inhA流行病學(xué)情況，探索適合本院快速篩選MTB耐藥菌株的方法，本研究對本院2014年7月至2017年3月基因芯片技術(shù)檢測MTB耐藥基因的數(shù)據(jù)進(jìn)行了回顧性分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1菌株來源 收集本院2014年7月至2017年3月分離的MTB 1 981株。

1.2儀器與試劑 北京奧博生物生產(chǎn)的Extractor36核酸快速提取儀、HybSet基因微陣列芯片雜交盒、SlideWasherTM8芯片洗干儀和LuScan10K-B微陣列芯片掃描儀等；PCR擴(kuò)增儀為美國ABI 7300；MTB耐藥基因檢測試劑由北京博奧生物生產(chǎn)。

1.3方法

1.3.1核酸提取 從Middlebrook7H9液體培養(yǎng)基中吸取相當(dāng)于1個麥?zhǔn)蠁挝粷岫鹊木鷳乙?5 μL于核酸提取管中，加入80 μL核酸提取液試劑，于Extractor36核酸快速提取儀振蕩5 min，95 ℃金屬浴5 min，5 000 r/min離心1 min，將收獲的核酸提取液放置于-20 ℃暫存。

1.3.2核酸擴(kuò)增 PCR擴(kuò)增試劑1、2和3平衡至室溫，瞬時離心至管底，分裝成每管18 μL，分別加入模板DNA 2 μL。擴(kuò)增程序:37 ℃ 600 s;94 ℃ 600 s;94℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環(huán)；94 ℃ 30 s，72 ℃ 60 s，10個循環(huán)；72 ℃ 420 s；置于冰水浴中。

1.3.3芯片雜交 按9 μL雜交緩沖液加3 μL擴(kuò)增產(chǎn)物的比例配制雜交反應(yīng)物，加熱至95 ℃變性5 min，立即冰水浴5 min。產(chǎn)物1為產(chǎn)物對照，與2種微陣列均進(jìn)行雜交。產(chǎn)物2為rpoB基因的擴(kuò)增產(chǎn)物，與利福平微陣列相對應(yīng)；產(chǎn)物3為katG基因及inhA基因啟動子的擴(kuò)增產(chǎn)物，與異煙肼微陣列相對應(yīng)。取13.5 μL混合液加入雜交芯片加樣孔中，置入HybSet芯片雜交盒中50 ℃雜交2 h。

1.3.4洗滌、干燥及掃描 依次以2×標(biāo)準(zhǔn)枸櫞酸水(SSC)+0.2%十二烷基硫酸鈉(SDS)、0.2×SSC各振蕩洗滌3 min，800 r/min離心5min，甩干后掃描、判讀結(jié)果。

1.3.5質(zhì)量控制 每次擴(kuò)增時均使用陽性對照和陰性對照，其中陽性對照可用于PCR 擴(kuò)增和雜交過程的質(zhì)控，陰性對照可用于監(jiān)測環(huán)境及操作過程中的污染情況；每張芯片上均設(shè)置空白對照、陰性和陽性內(nèi)對照、表面化學(xué)質(zhì)控探針、雜交陽性外對照探針及野生型探針，用于監(jiān)控雜交過程。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS18.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析,計數(shù)資料以率(%)表示，采用描述性統(tǒng)計分析。

2 結(jié) 果

2.1一般情況 2014年7月至2017年3月共檢測MTB耐藥基因患者1 981例，其中男1 330例(67.14%)，女651例(32.86%)，除30～<40歲年齡組男女比例相當(dāng)外，其余各年齡組男性均明顯多于女性。見表1。

表1 不同性別、年齡結(jié)核病患者情況比較[n(%)，n=1 981]

2.2MTB ropB耐藥基因檢出結(jié)果 1 981株MTB經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測為ropB野生型1 646株，突變型335株，突變率為16.91%(335/1 981)。共檢測耐利福平rpoB基因6個位點(diǎn)，突變類型13種。突變位點(diǎn)突變率由高至低依次為531[50.75%(170/335)]、516[21.19%(71/335)]、526[17.0%(157/335)]、511[14.33%(48/335)]、513[2.69%(9/335)]、533[2.39%(8/335)]。突變型分布見表2。

表2 335株耐利福平MTB ropB基因突變類型分布情況

2.3MTB異煙肼耐藥基因檢出結(jié)果 1 981株MTB經(jīng)基因芯片技術(shù)檢測共檢測出KatG野生型1 670株，KatG突變株310株，突變率為15.65%(310/1 981)； inhA野生型1 913株，inhA突變型68株，突變率為3.43%(68/1 981)，9株為二者合并突變株?？偼蛔兟蕿?8.6%(369/1 981)，其中KatG AGC→ACC突變型占所有耐異煙肼MTB突變總數(shù)的79.95%(295/369)。2個基因的突變型分布見表3。

表3 369株耐異煙肼MTB KatG和inhA基因突變譜及突變率

3 討 論

基因芯片技術(shù)是近年來興起的MTB耐藥基因檢測新技術(shù)，在國內(nèi)多中心驗證結(jié)果顯示，該方法檢測利福平耐藥靈敏度和特異度為87.56%和97.95%，檢測異煙肼耐藥靈敏度和特異度為80.34%和95.82%[2]。基因芯片法對利福平耐藥基因的檢測與表型檢測符合率達(dá)95.0%以上[3]。

rpoB基因突變絕大部分集中在RRDR 81 bp的密碼子上[4-5]。本院531位點(diǎn)突變率最高，占50.75%，與青島地區(qū)52.6%[6]接近,低于深圳的76.3%[7]；ropB基因突變率為16.91%(335/1 981)，略高于作者2016年進(jìn)行的耐藥表型的研究數(shù)據(jù)(13.57%)[8]，低于貴州的20.16%[9]。

異煙肼耐藥相關(guān)突變發(fā)生率具有較大的地區(qū)差異性。本研究結(jié)果顯示，異煙肼耐藥基因KatG突變率為15.65%，inhA突變率為3.43%，二者合計異煙肼耐藥基因突變率為18.6%，略高于作者2016年進(jìn)行的耐藥表型的研究數(shù)據(jù)(14.18%)[8]，與貴州類似[10]。KatG AGC→ACC突變率為79.95%，inhA突變率為18.7%。與青島[6]一致，接近深圳地區(qū)的84.6%[11]，高于福州的70.7%[12]、浙江的69.3%[13]和武漢的60.9%[14]。

耐藥表型與基因型之間不一致的原因可能有：(1)芯片沒有覆蓋所有的突變位點(diǎn)或突變基因型；(2)芯片檢測到的突變型可能是未引起耐藥的同義或錯義突變；(3)傳統(tǒng)藥敏試驗檢測以臨界水平判斷耐藥，而基因芯片法能檢測到比傳統(tǒng)藥敏試驗臨界水平更低的低度耐藥突變菌株。這些因素均可能對最終結(jié)果產(chǎn)生影響。

4 結(jié) 論

ropB基因531、516、526和511位點(diǎn)突變和KatG G→C突變是導(dǎo)致長沙市中心醫(yī)院MTB利福平和異煙肼耐藥的主要因素，基因芯片技術(shù)可作為本院MTB耐藥基因的快速篩選方法。