孫小華，馬艷弘，崔 晉，韓德果，程 果，竇泓喆，楊國(guó)慧 (東北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝園林學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 50030； 江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品加工研究所，江蘇 南京 004)

[摘 要] 【目的】 研究雙酶法提取無(wú)花果汁的最佳工藝參數(shù)，為制備無(wú)花果汁、釀造無(wú)花果酒奠定基礎(chǔ)?！痉椒ā?以無(wú)花果為材料，以出汁率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，研究纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間4個(gè)因素及其交互作用對(duì)無(wú)花果岀汁率的影響，利用響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果建立回歸方程，并對(duì)回歸方程進(jìn)行顯著性和方差分析，得到無(wú)花果果汁酶解提取最佳工藝參數(shù)并進(jìn)行試驗(yàn)驗(yàn)證?！窘Y(jié)果】 通過(guò)單因素試驗(yàn)得到的無(wú)花果果汁最佳酶解提取條件為：纖維素酶添加量1.5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，果膠酶添加量0.3%，酶解溫度55 ℃，酶解時(shí)間90 min。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)分析得出，無(wú)花果果汁的最佳酶解提取工藝條件為：纖維素酶添加量1.56%，果膠酶添加量0.28%，酶解溫度53 ℃，酶解時(shí)間90 min；在此條件下無(wú)花果的岀汁率為72.15%，與理論值(73.99%)基本吻合，且比未處理無(wú)花果出汁率提高了75.46%。纖維素酶添加量與酶解溫度和酶解時(shí)間、果膠酶添加量與酶解溫度和酶解時(shí)間、酶解溫度與酶解時(shí)間的交互作用均可在較大程度上影響無(wú)花果的岀汁率?！窘Y(jié)論】 通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)得到了雙酶法提取無(wú)花果汁的最佳工藝參數(shù)，該工藝可以大幅提高無(wú)花果出汁率。

無(wú)花果(FicuscaricaL.)，別名天仙果、明目果、映日果、奶漿果[1]，為桑科無(wú)花果屬多年生木本植物，其根、莖、葉、果實(shí)均可入藥，為典型的藥食兩用型水果，具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值，被譽(yù)為“生命之果”、“神圣之果”[2]。無(wú)花果不僅含有多種維生素、糖類、蛋白質(zhì)、脂肪、粗纖維等營(yíng)養(yǎng)成分，還富含多酚類物質(zhì)、花青素、活性多糖等成分，具有很強(qiáng)的抗氧化、抗衰老、保護(hù)心血管、抗癌、增強(qiáng)免疫力等藥理保健功效[3]，在國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)極其暢銷。無(wú)花果為呼吸躍變型果實(shí)，成熟衰老快，皮薄汁多，含糖量高，耐貯藏性差，貨架期短，極易腐爛變質(zhì)[4]。采用現(xiàn)代生物加工技術(shù)，開(kāi)發(fā)營(yíng)養(yǎng)保健的無(wú)花果果酒、果汁飲料等高附加值產(chǎn)品,成為解決無(wú)花果產(chǎn)業(yè)發(fā)展瓶頸的主要途徑[5]。

王鵬[6]以新疆當(dāng)?shù)氐孽r無(wú)花果為原料，采用果膠酶酶解技術(shù)，利用單因素試驗(yàn)結(jié)合正交試驗(yàn)優(yōu)化無(wú)花果酶解工藝，最佳條件為：果膠酶添加量0.6%,酶解溫度50 ℃,酶解時(shí)間60 min。這是目前國(guó)內(nèi)外僅有的關(guān)于無(wú)花果酶解工藝的研究報(bào)道，但該研究?jī)H利用果膠酶來(lái)酶解無(wú)花果，且研究對(duì)象僅是新疆當(dāng)?shù)氐臒o(wú)花果。江蘇太湖作為果業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)，具有不同于新疆的無(wú)花果品種，且人口眾多，產(chǎn)業(yè)發(fā)展前景廣闊。在無(wú)花果加工取汁時(shí)，由于其果漿中含有大量纖維素和果膠，使得果漿黏度增加[7-8]，導(dǎo)致出現(xiàn)原料壓榨性能差、利用率低、果酒生產(chǎn)成本高等問(wèn)題。據(jù)報(bào)道，利用生物酶解技術(shù)能有效分解細(xì)胞壁、細(xì)胞膜的纖維素和果膠等物質(zhì)，降低果漿黏度，進(jìn)而提高果品出汁率，降低果酒生產(chǎn)成本[9]。基于此，本研究以江蘇蘇州西山國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園的“瑪斯義陶芬”無(wú)花果為原料，以果膠酶和纖維素酶酶解為技術(shù)手段，以出汁率為考察指標(biāo)，通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，研究纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間等因素對(duì)無(wú)花果出汁率的影響以及各因素之間的交互作用，確定酶解制備無(wú)花果果汁適宜的工藝條件，以期為無(wú)花果的加工利用尤其是果酒開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)和試驗(yàn)參數(shù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試材：無(wú)花果采摘于江蘇蘇州西山國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)示范園區(qū)有限責(zé)任公司無(wú)花果種植基地，品種為“瑪斯義陶芬”，八成熟，采摘后置于-20 ℃冰箱中備用。

試劑：纖維素酶(活力≥400 U/mg)、果膠酶(活力≥500 U/g)，均購(gòu)于上海瑞永生物科技有限公司。

儀器：MJ-BL15U11型打漿機(jī)，廣東美的生活電器制造有限公司；ML204型電子分析天平，梅特勒-托利多(上海)有限公司；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋，上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；TGL-16B臺(tái)式離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 無(wú)花果果汁酶解提取的單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)

1.2.1 單因素試驗(yàn) 取適量無(wú)腐爛、無(wú)破損、成熟程度一致的無(wú)花果解凍后洗凈，打漿成無(wú)花果漿后，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間為因素進(jìn)行試驗(yàn)，考察其對(duì)無(wú)花果出汁率的影響。

(1)纖維素酶添加量的影響。將無(wú)花果漿分裝成7等份，每份50 g，均加質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5%的果膠酶，再分別添加0，0.5%，1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的纖維素酶并攪拌，45 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計(jì)算出汁率。

(2)果膠酶添加量的影響。將無(wú)花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶，再分別添加0，0.1%，0.3%，0.5%，0.7%，0.9%，1.1%(均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)的果膠酶并攪拌，45 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計(jì)算出汁率。

(3)酶解溫度的影響。將無(wú)花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，分別在35，40，45，50，55，60，65 ℃水浴鍋中酶解90 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計(jì)算出汁率。

(4)酶解時(shí)間的影響。將無(wú)花果漿分裝成7等份，每份50 g，均添加2.0%的纖維素酶和0.5%的果膠酶，在45 ℃水浴鍋中分別酶解30，60，90，120，150，180 min，90 ℃水浴鍋中滅酶5 min，4 500 r/min離心20 min，取上清液，計(jì)算出汁率。

1.2.2 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間為因素，以岀汁率為響應(yīng)值，采用Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)進(jìn)行四因素三水平試驗(yàn)[10-11]，其因素與水平見(jiàn)表1。采用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定最佳酶解條件。

表1 無(wú)花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

1.3 數(shù)據(jù)處理

無(wú)花果出汁率=(無(wú)花果上清液質(zhì)量/無(wú)花果果漿質(zhì)量)×100%[6]。

所有試驗(yàn)均做3次平行，結(jié)果取平均值，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用EXCEL軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)花果果汁酶解提取工藝的單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量的影響 如圖1所示，當(dāng)纖維素酶添加量在0～1.5%時(shí)，無(wú)花果出汁率隨著纖維素酶添加量的增大而升高，且在纖維素酶添加量為1.5%時(shí)出汁率最高，達(dá)到70.8%；當(dāng)纖維素酶添加量大于1.5%時(shí)，出汁率變化趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)橐欢康睦w維素酶酶解破壞了細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，細(xì)胞內(nèi)容物溶出，導(dǎo)致出汁率提高[12]；但當(dāng)纖維素酶添加量達(dá)到最佳值后，細(xì)胞內(nèi)容物已經(jīng)充分溶出，出汁率達(dá)到最大，再繼續(xù)提高加酶量時(shí)，出汁率也不再提高[13]。因此，確定1.5%為適宜的纖維素酶添加量。

2.1.2 果膠酶添加量的影響 如圖2所示，果膠酶添加量在0～0.3%時(shí)，無(wú)花果出汁率隨著果膠酶添加量的增大而升高，且在果膠酶添加量為0.3%時(shí)出汁率達(dá)到最高(67.71%)；當(dāng)果膠酶添加量大于0.3%時(shí)，出汁率隨著纖維素酶添加量的增加而緩慢下降。這可能是因?yàn)楫?dāng)果膠酶添加量達(dá)到最佳值時(shí)，細(xì)胞內(nèi)容物已經(jīng)充分溶出，出汁率達(dá)到最大，此時(shí)繼續(xù)提高加酶量，出汁率不再提高[14]。因此，確定果膠酶添加量以0.3%為宜。

圖1 纖維素酶添加量對(duì)無(wú)花果岀汁率的影響Fig.1 Effect of cellulase addition amount on fig juice yield

2.1.3 酶解溫度的影響 如圖3所示，當(dāng)酶解溫度在35～55 ℃時(shí)，無(wú)花果出汁率隨著溫度的升高而增加，且在55 ℃時(shí)出汁率最高(71.09%)；當(dāng)溫度高于55 ℃時(shí)，出汁率隨著溫度升高而下降。這是由于纖維素酶和果膠酶的活性具有最適合的溫度，在一定溫度范圍內(nèi)，酶活性會(huì)隨著溫度升高而提高；到最適溫度時(shí)，酶活性最高,催化能力最強(qiáng)[15]；當(dāng)溫度高于最適溫度時(shí)，酶活性降低，酶解反應(yīng)受到抑制，致使岀汁率有所降低[14]。因此，確定酶解溫度以55 ℃為宜。

2.1.4 酶解時(shí)間的影響 如圖4所示，當(dāng)酶解時(shí)間在30～90 min時(shí)，無(wú)花果出汁率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而升高，且在90 min時(shí)出汁率最高(68.12%)；超過(guò)90 min時(shí)，出汁率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而下降。這可能是因?yàn)殡S著時(shí)間延長(zhǎng)，酶活力得到充分發(fā)揮，酶解反應(yīng)較完全，出汁率不斷升高；在最適宜的時(shí)間酶促反應(yīng)徹底，出汁率達(dá)到最高值；超過(guò)最適宜時(shí)間則纖維素果膠類物質(zhì)基本分解完畢，酶解反應(yīng)基本結(jié)束，出汁率不再增加而逐漸趨于平緩甚至略微下降[15]。因此，確定90 min為適宜的酶解時(shí)間。

圖3 酶解溫度對(duì)無(wú)花果岀汁率的影響Fig.3 Effect of enzymolysis temperature on fig juice yield

2.2 無(wú)花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與模型建立 在單因素試驗(yàn)結(jié)果基礎(chǔ)上，利用Design-Expert 8.0.6中的Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)無(wú)花果酶解工藝優(yōu)化響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。對(duì)表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合分析，得到以出汁率(Y)為響應(yīng)值的回歸方程：

式中：Y為出汁率，X1、X2、X3、X4分別為纖維素酶添加量、果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間的變量值。

表2 無(wú)花果果汁酶解提取工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Design and results of RSM test for enzymolysis extraction of fig juice

表2(續(xù)) Continued table 2

表3 無(wú)花果果汁酶解提取工藝回歸方程的方差分析Table 3 Variance analysis on regression equations for enzymolysis extraction of fig juice

2.2.3 響應(yīng)面分析 由圖5可以看出，在6個(gè)交互項(xiàng)中，任何2個(gè)交互因素的響應(yīng)面都存在最高點(diǎn)，纖維素酶添加量(X1)與酶解溫度(X3)、纖維素酶添加量(X1)與酶解時(shí)間(X4)、果膠酶添加量(X2)與酶解溫度(X3)、果膠酶添加量(X2)與酶解時(shí)間(X4)、酶解溫度(X3)與酶解時(shí)間(X4)的響應(yīng)面曲面坡度均較陡峭，說(shuō)明兩者的交互作用對(duì)無(wú)花果出汁率的影響極顯著。

圖5 因素的交互作用對(duì)無(wú)花果出汁率的影響Fig.5 Effect of the interaction of factors on the juice yield of figs

2.2.4 驗(yàn)證試驗(yàn) 通過(guò)軟件Design Expert 8.0.6求解回歸方程，得出最優(yōu)的理論酶解條件為：纖維素酶添加量1.56%、果膠酶添加量0.28%、酶解溫度53.37 ℃、酶解時(shí)間89.54 min，此條件下無(wú)花果的理論岀汁率為73.99%。為了檢驗(yàn)工藝的可靠性，考慮到實(shí)際操作方便，將最優(yōu)酶解條件適當(dāng)修正為：纖維素酶添加量1.56%，果膠酶添加量0.28%，酶解溫度53 ℃，酶解時(shí)間90 min，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，得出無(wú)花果的實(shí)際岀汁率為72.15%，與理論預(yù)測(cè)值吻合，說(shuō)明根據(jù)該模型得到的最優(yōu)酶解條件是可行的。經(jīng)測(cè)未經(jīng)酶解處理的無(wú)花果岀汁率為41.12%，酶解最佳工藝條件下的理論岀汁率較之高79.94%，實(shí)際岀汁率較之高75.46%，說(shuō)明該酶解工藝可以有效地提高無(wú)花果岀汁率。

3 討 論

本研究系統(tǒng)分析了纖維素酶和果膠酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間對(duì)無(wú)花果岀汁率的影響，結(jié)果表明，隨著纖維素酶和果膠酶添加量的增加、酶解溫度的升高和酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，無(wú)花果岀汁率總體上呈先增長(zhǎng)后持平的趨勢(shì)。主要原因如下：其一，纖維素與果膠作為纖維素酶和果膠酶的底物，它們是構(gòu)成無(wú)花果細(xì)胞壁的重要成分，因此不斷添加纖維素酶和果膠酶會(huì)破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)容物不斷溶出直至溶出幾乎完畢，從而導(dǎo)致出汁率由不斷增大到不再上升；其二，在適宜的溫度范圍內(nèi)，酶具有高活性，超越了適宜溫度范圍時(shí)，則高活性受到抑制，因此酶解反應(yīng)中出汁率亦會(huì)出現(xiàn)先增長(zhǎng)后持平的現(xiàn)象；其三，在適宜時(shí)間內(nèi)酶解反應(yīng)高效，時(shí)間太久時(shí)反應(yīng)幾乎會(huì)消耗所有的底物，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物基本釋放完畢，酶解反應(yīng)趨于結(jié)束。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)建立了可靠的預(yù)測(cè)模型，優(yōu)化了最佳的酶解工藝，在最佳條件下的出汁率與理論值擬合度很高，說(shuō)明此工藝參數(shù)可靠。與不經(jīng)過(guò)酶解的無(wú)花果相比，利用優(yōu)化的酶解工藝岀汁率提高了75.46%。本研究與王鵬[6]的研究結(jié)果存在一定的差異，其原因在于不同的無(wú)花果品種及其特性不同，且受生態(tài)環(huán)境的影響；另外，酶活力規(guī)格不同，研究結(jié)果也會(huì)有所差異。

在無(wú)花果的酶解工藝優(yōu)化研究領(lǐng)域中，本研究使用了纖維素酶和果膠酶2種酶優(yōu)化無(wú)花果的酶解工藝，打破了前人僅利用果膠酶進(jìn)行酶解工藝研究的局限性。由于纖維素酶和果膠酶均為特異性酶，造成無(wú)花果細(xì)胞可破解的多糖種類增加，這不但有利于提高出汁率，而且增加了酵母酒精發(fā)酵可利用的碳源，一定程度上提高了酒精度，有利于無(wú)花果的釀酒產(chǎn)業(yè)發(fā)展[17]；另外，利用纖維素酶協(xié)同果膠酶酶解無(wú)花果可以更大程度地保證食物的消化吸收[18]。

4 結(jié) 論

本研究通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化雙酶法提取無(wú)花果汁的工藝條件，得出其酶解最優(yōu)工藝條件為：纖維素酶添加量1.56%、果膠酶添加量0.28%、酶解溫度53 ℃、酶解時(shí)間90 min。此條件下無(wú)花果的出汁率高達(dá)72.15%，比未經(jīng)酶解處理的無(wú)花果出汁率提高了75.46%，可見(jiàn)利用雙酶法可顯著提高無(wú)花果出汁率，有利于降低無(wú)花果的加工成本。