王 寧,譚 麗,侯中偉

(1.中山大學附屬第七醫(yī)院,廣東 深圳 518107; 2.廣州中醫(yī)藥大學第二臨床醫(yī)學院，廣東 廣州 510006;3.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029)

原發(fā)性肝癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)是起源于肝細胞或肝內(nèi)膽管上皮細胞的惡性腫瘤。2012年，全球范圍內(nèi)男性肝癌的發(fā)病率和死亡率分居第5位和第2位，女性肝癌的發(fā)病率和死亡率分居第7位和第6位[1]。中國肝癌死亡率分別占同期全球第3位，同期中國死亡38萬人，占同期中國癌癥死亡總數(shù)的17.4%[2]。2013年我國仍有36.2萬人確診肝癌[3]。因此，降低原發(fā)性肝癌的發(fā)病率和死亡率在肝癌防治過程中起著關鍵的作用。在臨床研究中發(fā)現(xiàn)[4-5]，艾灸在治療肝病進程中存在著明確的臨床療效。故本實驗在采用二乙基亞硝胺(Diethylnitrosamine,DEN)建立HCC肝癌模型的同時，用不同灸量的小艾炷干預模型大鼠，觀察艾灸肝俞穴對HCC模型癌前病變期大鼠血清中腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor-α，TNF-α)、甲胎蛋白(Alphafetoprotein,AFP)含量的影響以及肝臟組織病理形態(tài)學的變化，比較不同灸量之間的效果差異，尋求最佳灸量。

1 材料

1.1 實驗動物及分組

55只清潔級Wistar雄性大鼠,體質(zhì)量(200±10)g，在實驗前適應性飼養(yǎng)1周后，按隨機數(shù)字表法分為對照組(10只)、模型組(15只)、艾灸1組(15只)、艾灸2組(15只)。在整個實驗過程中，大鼠均飼養(yǎng)于溫度為20℃～25℃濕度為55%左右的動物房。實驗用大鼠由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供，許可證號：SCXK京2012-0001。

1.2 主要試劑、藥品和設備

試劑：蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京普利萊基因技術有限公司)，TNF-α、AFP檢測試劑盒(北京環(huán)宇金科生物醫(yī)學技術有限公司)；藥品：麻醉劑采用濃度為1.5%的戊巴比妥鈉,DEN溶液(濃度為0.95 g/mL，購于美國Sigma公司，批號Sigma-N0756)；儀器：AnymicroDSSTM圖像采集系統(tǒng)和德國LEICARM2245型石蠟切片機；艾絨(型號：80:1)。

1.3 模型制備

本實驗采用DEN腹腔注射法復制HCC模型[6]。首先將濃度為0.95 g/mL的DEN溶液溶于0.9% Nacl溶液中，配制成濃度為10 mg/mL的溶液。然后根據(jù)大鼠體質(zhì)量，按照50 mg/kg的劑量進行腹腔注射。注射頻次為：2次/周，期間間隔3～4天或84 h，連續(xù)10周。HCC模型造模成功的主要標志為肝臟病理組織切片可見肝小葉結構完全破壞，肝板消失，細胞核深染，核/質(zhì)比增大，異型性增加，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象，局部誘導出腫瘤灶；解剖可見肝臟質(zhì)地變硬，體積明顯萎縮變小，表面出現(xiàn)大量大小不一的結節(jié)，或見腹水，或見肺部及胃部出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶；形態(tài)出現(xiàn)形體消瘦、體重減輕、行動遲緩等。

2 方法

2.1 干預方法

模型組和對照組大鼠只做固定處理，不做艾灸。艾灸1組、艾灸2組的大鼠注射完濃度為10 mg/mL的DEN溶液后，固定于動物臺上，采用小艾炷灸肝俞穴，分別按照3壯/穴、6壯/穴的灸量進行干預，每隔1日1次，連續(xù)艾灸10周。具體艾灸方法為：將艾絨做成1/4麥粒大小的小艾炷(呈圓錐形)，重量約5 mg/壯；剃除艾灸組大鼠穴區(qū)3 cm×2 cm(長×寬)的鼠毛，暴露穴位周圍皮膚。待大鼠固定后，將小艾炷放置在大鼠兩側肝俞穴上點燃，艾炷燃滅后，更換艾炷再次施灸。大鼠肝俞穴的定位參照《實驗針灸學》[7]的標準取穴。

2.2 取材與檢測

造模完成后，所有大鼠尾靜脈取1.5 mL血置于肝素抗凝管中，靜置2 h后，離心15 min，轉(zhuǎn)速為3 500 r/min。離心后取250 μL血清裝入凍存管，放置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)每只大鼠的體重，按0.25 mL/100 g的劑量腹腔注射1.5%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后，取出肝臟，切取肝臟組織并浸泡于甲醛溶液中，1周后進行脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟、HE染色、封片，最后采用光學顯微鏡觀察大鼠肝臟組織的病理變化。血清TNF-α、AFP的測定采用ELisa(酶聯(lián)免疫吸附法)檢測。

2.3 統(tǒng)計學處理

3 結果

3.1 各組大鼠造模后血清TNF-α、AFP含量的比較

造模結束后，與對照組相比，模型組血清TNF-α、AFP含量均明顯升高(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。與模型組相比，艾灸1組血清TNF-α、AFP含量均明顯血清(P<0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。艾灸2組降低TNF-α、AFP含量均降低(P>0.05)，但無統(tǒng)計學意義；艾灸1組與艾灸2組相比，TNF-α、AFP含量無明顯變化(均P>0.05)。見表1。

表1 各組大鼠造模后TNF-α、AFP的含量比較

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05；實驗過程中大鼠有死亡，故樣本數(shù)少于初始量。

3.2 各組大鼠肝組織病理學變化

對照組大鼠肝細胞胞漿胞核均勻,肝細胞索排列整齊，呈放射狀，肝細胞形態(tài)正常；模型組細胞核深染，異型性增加，核/質(zhì)比增大，小葉結構完全破壞，部分出現(xiàn)核固縮和核碎裂現(xiàn)象；艾灸1組存在少量肝板，核/質(zhì)比略增大，肝細胞有雙核，細胞核異型性低；艾灸2組，細胞核深染、核/質(zhì)比增大，出現(xiàn)核固縮現(xiàn)象，肝細胞有雙核。見封三彩圖1。

4 討論

從歷代文獻記載可以發(fā)現(xiàn)，灸法在防治腫瘤方面歷史悠久。原發(fā)性肝癌在傳統(tǒng)中醫(yī)學屬“癥瘕”“積聚”“臌脹”等范疇?！毒霸廊珪ぞ矶酚涊d:“……但察其脈絡所由者，皆當按其處而通灸之，火力所到，則其堅聚之氣自然以漸解散”，不僅說明灸法能夠散結化滯，而且說明艾灸達到有效的灸量才能產(chǎn)生最佳的效果。有研究表明[8],灸法在肝癌防治過程中的各個階段都有積極的作用。背俞穴是臟腑之氣匯聚之處，《靈樞·背腧第五十一》指出：“按其處，……乃其俞也。灸之則可，刺之則不可。氣盛則瀉之，虛則補之”,說明背俞穴可以采用灸法對所屬臟腑補虛瀉實。根據(jù)《素問》“治臟者治其俞，治腑者治其合”的中醫(yī)治療原則，取肝俞穴能夠直接、快速、有效地激發(fā)肝臟的氣血，調(diào)節(jié)臟腑陰陽。而且相關研究發(fā)現(xiàn)瘢痕灸肝俞穴對HCC的效果要優(yōu)于足三里穴[9]。在多種肝癌模型中,DEN誘發(fā)肝癌癌前病變的階段性特征與人類病程類似[10],故本實驗采用DEN復制HCC模型，并在造模的同時采用不同灸量的小艾炷灸干預，從而觀察不同艾灸肝俞穴對HCC模型大鼠癌前病變期血清中TNF-α、AFP及肝臟組織形態(tài)的影響。

TNF-α是一種具有促炎活性和免疫調(diào)節(jié)功能的炎癥因子，在腫瘤微環(huán)境中的組成性表達是許多惡性腫瘤的共同特征。在肝癌的研究中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可通過多種途徑促進肝癌細胞的增殖及遷移，抑制肝癌細胞的凋亡。主要體現(xiàn)在以下幾個途徑：①TNF-α與其受體結合后，通過激活caspase級聯(lián)反應通路、NF-κB信號等通路，促進細胞分裂，進一步加快肝癌細胞的增殖[11-14];②TNF-α在腫瘤微環(huán)境中誘導TNC的表達,進而促進了肝癌細胞的遷移[15];③TNF-α通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激信號通路誘導肝癌細胞自噬,從而促進肝癌細胞的增殖[16];④通過TNF-α/ROS/HIF-1途徑明顯上調(diào)肝癌細胞中 FoxM1的表達并增強其啟動子的活性，從而促進肝癌細胞的增殖和抗凋亡[17];⑤TNF-α介導的線粒體解偶聯(lián)作用可以促進肝癌細胞的遷移[18]?？梢园l(fā)現(xiàn)TNF-α是通過多種途徑調(diào)控著肝癌細胞的增殖、凋亡與遷徙。

AFP來源于胚胎的干細胞,在臨床上不僅是肝癌的經(jīng)典腫瘤標記物，當作診斷肝癌的主要標準[19]，而且還可以結合活檢、腹水等指標提高HCC惡性程度及預后的預測[20-21]。研究表明[22-23]：AFP是一種免疫抑制性蛋白質(zhì)，具有免疫抑制作用，主要表現(xiàn)為促進肝癌細胞的生長, 并且AFP可以誘導肝癌患者T細胞和B細胞的自發(fā)應答， AFP疫苗可以作為腫瘤治療的潛在工具。在本實驗中，模型組大鼠血清TNF-α、AFP含量要明顯高于對照組，而有直接灸干預的大鼠血清TNF-α、AFP含量要低于模型組，有降低趨勢，說明直接灸能夠降低HCC大鼠血清TNF-α、AFP的含量，直接灸在一定程度上能夠抑制大鼠HCC細胞的增殖。結合光鏡下肝臟組織切片HE染色的觀察結果發(fā)現(xiàn)，直接灸組肝癌細胞的異型性、核固縮要少于模型組。

本實驗結果表明：①直接灸肝俞穴能夠?qū)CC模型大鼠癌前病變期TNF-α、AFP及肝臟組織形態(tài)有良性調(diào)節(jié)作用，在一定程度上能夠抑制肝癌細胞的增殖；②兩組直接灸中，艾灸1組的效果更好，但與艾灸2組比較，組間無差異，可能跟樣本量的大小、艾灸干預的周期等有關，需進一步研究；③直接灸肝俞穴對HCC的作用機制可能與艾灸抑制肝細胞中TNF-α介導的相關信號通路有關。因此可以認為，直接灸能夠適當抑制肝癌細胞的增殖，且灸量對肝癌細胞的影響存在差異。