周海純，郭蕊珠 ,王艷麗，趙海深，孔德鳳，蔡國(guó)鋒

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150001；2.哈爾濱市急救中心，黑龍江 哈爾濱 150040；3.黑龍江護(hù)理高等專(zhuān)科學(xué)校,黑龍江 哈爾濱 150301；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué),黑龍江 哈爾濱 150040)

高脂血癥是動(dòng)脈硬化主要危險(xiǎn)因素之一，同時(shí)是導(dǎo)致腦梗死、腦出血等腦血管疾病的主要誘發(fā)因素[1]，在我國(guó)隨著生活方式及飲食結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)變，該病發(fā)病率逐年上升，并且趨于年輕化，目前國(guó)內(nèi)醫(yī)藥市場(chǎng)對(duì)于高脂血癥的治療尚缺乏特效藥物，臨床治療以西藥，如羥甲戊二酰輔酶A還原酶抑制劑、膽固醇吸收抑制劑、煙酸類(lèi)調(diào)脂藥、膽固醇合成抑制劑和膽汁酸螯合劑等藥物為主，長(zhǎng)期服用肝腎損害極大。北方地區(qū)由于生活區(qū)域氣候寒冷，飲食以肉食、酒食為主，高脂血癥頻發(fā)，歷代醫(yī)生在長(zhǎng)期與疾病的斗爭(zhēng)中，協(xié)定處方調(diào)脂飲經(jīng)過(guò)大量研究，臨床療效確切，目前是臨床治療高脂血癥及預(yù)防心腦血管疾病的重要手段[2-3]。在臨床應(yīng)用廣泛，治療效果顯著，同時(shí)在長(zhǎng)期臨床工作中發(fā)現(xiàn)微針?lè)稣钚啊?shí)則祛痰飲、通脈絡(luò)，虛則補(bǔ)肝腎虧損，調(diào)脾胃。針?biāo)幉⒂?，相輔相成，增加療效。故采取此次實(shí)驗(yàn)研究，奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

選擇健康成年SPF級(jí)SD大鼠雌雄各半，共計(jì)120只，大鼠體重分布為(200±20)g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證號(hào)：SCXK (吉)2012-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)于黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，清潔級(jí)，控制適宜溫度，保持適合濕度。

1.2 試驗(yàn)藥品

1.2.1 調(diào)脂飲組成 調(diào)脂飲為新疆藥王王仁老先生自擬經(jīng)驗(yàn)方，藥物由丹參、荷葉各15 g,山楂35 g,甘草15 g,何首烏10 g、枸杞、菊花、虎杖、蟬蛻各15 g,共9味藥物組成。

1.2.2 調(diào)脂飲功效 主要治療高脂血癥，功效為改善血脂水平、調(diào)整脂質(zhì)代謝。

1.2.3 調(diào)脂飲顆粒制備 第一步：浸膏制備。以上共同煎煮2次，2 h/次，將濾液濃縮，制成浸膏，控制相對(duì)密度1.10～1.15，控制溫度60℃。

第二步：稠膏制備。將浸膏冷卻，達(dá)到室溫后選擇乙醇溶液攪拌均勻，混合物質(zhì)要求乙醇百分比達(dá)到50%，16 h后抽取混合物質(zhì)上清液，并將乙醇回收，制成稠膏，控制相對(duì)密度1.20～1.25，控制溫度60℃[4]。

第三步：顆粒制備。將上述制備的稠膏，分別混合固定比例的蔗糖、糊精攪拌均勻，風(fēng)干處理，顆粒制備完成，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)制劑室制備。儲(chǔ)存，灌胃使用。

1.3 試驗(yàn)儀器

日立7180型全自動(dòng)生化分析儀；TGL-19臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)；電熱恒溫水浴箱；MP2000D 電子天平。

1.4 試驗(yàn)造模及分組

預(yù)實(shí)驗(yàn)采取血清記錄實(shí)驗(yàn)前基礎(chǔ)值;華佗牌針灸針(0.3×40 mm,蘇州魯躍醫(yī)療器械有限公司)，108只SPF級(jí)SD大鼠高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)時(shí)間持續(xù)45天，檢測(cè)TC、TG、HDL-C、LDL-C，確定造模成功大鼠，選擇60只隨機(jī)分為模型組、對(duì)照組、針?biāo)幗M，共3組。

1.5 干預(yù)方法

模型組：灌胃，灌胃等體積標(biāo)準(zhǔn)蒸餾水。1次/日。

對(duì)照組: 調(diào)脂飲低劑量，顆粒稀釋?zhuān)辔笜?biāo)準(zhǔn)0.45 g·kg，1次/日。

針?biāo)幗M：調(diào)脂飲，顆粒稀釋?zhuān)辔笜?biāo)準(zhǔn)0.45 g·kg，1次/日。微針取穴：豐隆、足三里、中脘、脾俞;微針刺法：捻轉(zhuǎn)進(jìn)針，得氣后留針20 min，每10 min行針1次，1次/日。

1.6 調(diào)脂飲急性毒理試驗(yàn)

開(kāi)展高劑量的調(diào)脂飲急性毒理試驗(yàn)，檢驗(yàn)調(diào)脂飲方劑的安全性。

1.7 熒光定量PCR檢測(cè)

引物設(shè)計(jì)與常規(guī) PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank已發(fā)表的大鼠Hes5、Mash1、Ngn1、Ngn2序列和β-Actin的序列，應(yīng)用Premier5. 0設(shè)計(jì)5對(duì)引物。

上游引物 Hes1-F 5′-ATGCCAGCTGATATTGG-3′;下游引物 Hes1-R 5′-GGCGGGGTGCGCCTGCCCGGGG-3′。

引物設(shè)計(jì)與常規(guī) PCR擴(kuò)增根據(jù)GenBank 已發(fā)表的大鼠Hes1序列和β- actin的序列，應(yīng)用 Premier5.0設(shè)計(jì)2對(duì)引物，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度分別為480 bp(目的基因的片段長(zhǎng)度)和640 bp(內(nèi)參基因的片段長(zhǎng)度)。上游引物β-Actin-F 5′-CGTTGACATCCGTAGACCTC-3′;下游引物β-Actin-R 5′-GGGAGGGTGAGGGACTTCCTGT-3′。

PCR反應(yīng)采用50 μL 體系:10×Buffer 5 μL、dNTPs 4 μL、上下游引物各1 μL、Taq酶1 μL、模板2 μL、ddH2O 36 μL。

具體步驟如下：第一步驟：選擇95℃預(yù)變性5 min;第二步驟：選擇95℃再次變性30 s；第三步驟：選擇55℃退火持續(xù)30 s； 第四步驟：選擇72℃延伸持續(xù)45 s； 第五步驟：選擇30個(gè)循環(huán)；第六步驟：選擇72℃延伸持續(xù)10 min。第七步驟：選擇1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳實(shí)驗(yàn)用來(lái)檢測(cè)完成的PCR產(chǎn)物。

1.8 總RNA質(zhì)量檢測(cè)

細(xì)胞的總RNA用Trizol法提取，所得RNA溶解于DEPC處理的ddH2O中。采用瓊脂糖凝膠電泳分析RNA的完整度，采用分光光度法測(cè)定RNA的濃度和純度。實(shí)驗(yàn)中所得樣品的OD260/OD280值均在1.8～2.0范圍之內(nèi)，并根據(jù)OD260計(jì)算濃度，調(diào)整RNA的濃度為500 ng/μL；瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表示，28S rRNA與18S rRNA的亮度比值約為2∶1，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)中所抽提得到的總RNA質(zhì)量較好，無(wú)降解，可以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的要求。見(jiàn)圖1。

表1 對(duì)血清TC、TG、HDL-C、LDL-C含量的影響

注：與模型組比較,AP<0.05,BP<0.01,CP>0.05;與對(duì)照組比較,**P<0.05,***P<0.01,*P>0.05。

圖1 總RNA的質(zhì)量檢測(cè)

1.9 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 TC、TG、HDL-C、LDL-C比較

高脂血癥大鼠模型針?biāo)幗M大鼠與對(duì)照組，TC、TG、HDL-C、LDL-C比較(P均<0.01)，提示造模成功。

表1顯示：高脂血癥大鼠經(jīng)過(guò)單純給藥與針?biāo)幹委熀?，TC、TG含量均有明顯改善，與模型組相比，均具有極顯著差異(P<0.01)。高脂血癥大鼠經(jīng)過(guò)針?biāo)幗M和對(duì)照組治療均有效，但針?biāo)幗M與對(duì)照組比較無(wú)顯著性差異(P>0.05)。因此針?biāo)幗M和對(duì)照組治療高脂血癥大鼠均有效。

針?biāo)幗M、對(duì)照組與模型組相比，HDL-C含量均升高趨勢(shì);對(duì)照組HDL-C含量未能達(dá)到正常水平。而針?biāo)幗M效果顯著，與對(duì)照組比較(P<0.05)，說(shuō)明針?biāo)幗M降低血清中HDL-C含量的效果最佳。

針?biāo)幗M、對(duì)照組與模型組相比，LDL-C含量均降低趨勢(shì);對(duì)照組LDL-C含量未能達(dá)到正常水平。而針?biāo)幗M效果顯著，與對(duì)照組比較(P<0.05)，說(shuō)明針?biāo)幗M與對(duì)照組比較針?biāo)幗M降低血清中LDL-C含量的效果最佳。

2.2 Hes5 mRNA結(jié)果

Hes5 mRNA提示血脂代謝產(chǎn)生血管內(nèi)皮破壞抑制因子，Hes5 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果升高提示血管保護(hù)修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，結(jié)果可見(jiàn)針?biāo)幗M、對(duì)照組與模型組相比Hes5 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果均為升高趨勢(shì)(P<0.01);并且時(shí)間越延長(zhǎng)Hes5 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果升高趨勢(shì)越明顯。針?biāo)幗M和對(duì)照組比較針?biāo)幗MHes5 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果的效果最佳，并且連續(xù)28天效果最佳。因此得出結(jié)論針?biāo)幗M在治療28天時(shí)對(duì)血管保護(hù)修復(fù)機(jī)制活性最強(qiáng)。見(jiàn)表2～3、圖2。

表2 Hes5和β-Actin引物設(shè)計(jì)

2.3 Mash1 mRNA結(jié)果

Mash1 mRNA提示血脂代謝產(chǎn)生血管內(nèi)皮破壞因子，所以Mash1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果減低提示血管保護(hù)修復(fù)機(jī)制增強(qiáng)，針?biāo)幗M、對(duì)照組與模型組相比Mash1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果均為減低趨勢(shì)(P<0.01);并且時(shí)間越延長(zhǎng)Mash1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果均表現(xiàn)減低趨勢(shì)越明顯。針?biāo)幗M和對(duì)照組比較針?biāo)幗MMash1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果的效果最佳，并且連續(xù)28天效果最佳。因此得出結(jié)論針?biāo)幗M在治療28天時(shí)對(duì)血管保護(hù)修復(fù)機(jī)制活性最強(qiáng)。見(jiàn)表4～5、圖3。

圖2 Hes5 mRNA普通PCR電泳圖

表3 Hes5 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果

表4 Mash1和β-Actin引物設(shè)計(jì)

表5 Mash1 mRNA相對(duì)表達(dá)結(jié)果

圖3 Mash1 mRNA普通PCR電泳圖

2.4 調(diào)脂飲急性毒理試驗(yàn)結(jié)果

因調(diào)脂飲預(yù)試驗(yàn)未能檢測(cè)LD5Q，因此僅完成最大給藥量實(shí)驗(yàn)。按照最大可灌濃度及最大灌胃容量給藥[5-7]，未見(jiàn)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物異常及死亡，實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證調(diào)脂飲對(duì)于小鼠的最大耐受量≥150 g/kg， 此劑量臨床成人標(biāo)準(zhǔn)量的454倍以上。依據(jù)急性毒性分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為該受試藥物對(duì)受試動(dòng)物無(wú)急性毒性。

3 討論

高脂血癥中醫(yī)并沒(méi)有明確病名，可將其歸屬為中醫(yī)的“痰飲”“瘀血”等范疇[8]。研究表明，針灸、中藥治療高脂血癥均有良好的效果，并認(rèn)為痰濁貫穿該病的始終，一方面痰飲是高脂血癥的病理產(chǎn)物，另一方面痰飲又是導(dǎo)致高脂血癥的病理因素[9-10]。痰飲的形成與人體的津液代謝相關(guān)，涉及到脾、腎、肝等臟腑，其中以脾臟功能失常為主，脾失健運(yùn)則影響水谷精微與水液運(yùn)化、輸布，使水谷津液不能轉(zhuǎn)化為人體所需要的氣血津液，這些物質(zhì)聚而成痰濁，危害人體健康，與《景岳全書(shū)》中所記載的“痰涎本皆氣血，水谷津液化得其正則為津血，化失其正，則為痰濁”不謀而合。瘀血也是高脂血癥的另一重要因素，與痰飲成為高血脂的兩大病理因素[11]。高脂血癥其中醫(yī)病機(jī)為本虛標(biāo)實(shí)，本虛以脾、腎虛為主，標(biāo)實(shí)以瘀血、痰濕為主。因此本次選擇針刺、中藥自擬方以健脾化痰、活血化瘀、補(bǔ)益脾腎為基本治則。

上個(gè)世紀(jì)90年代，就有研究表明針灸可以通過(guò)刺激交感神經(jīng)來(lái)促進(jìn)激素的分泌，例如腎上腺素等，使細(xì)胞膜上腺苷酸環(huán)化酶激活，增加細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷，以促進(jìn)脂肪分解，達(dá)到降脂的目的[12]。豐隆為胃經(jīng)之絡(luò)穴,通脾胃兩經(jīng)，針刺此穴可調(diào)節(jié)脾胃臟腑功能，促進(jìn)水谷精微與津液的正常運(yùn)化與輸布，同時(shí)該穴為治痰飲之要穴，《玉龍歌》中就有關(guān)于豐隆穴治療痰飲的記載,書(shū)中曰:“痰多宜向豐隆尋”。 足三里為胃經(jīng)之合穴，同時(shí)又為人體保健之要穴，臨床應(yīng)用廣泛，具有健脾和胃、化痰通絡(luò)之功。國(guó)內(nèi)學(xué)者認(rèn)為[13]“血瘀致病，三里療之”，通過(guò)對(duì)足三里穴位的針刺，可補(bǔ)中升陽(yáng)，陽(yáng)升則氣行，氣行以促進(jìn)人體血液的運(yùn)行，血行則瘀血自消。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證明[14]，通過(guò)對(duì)高脂血癥新西蘭兔給予足三里穴、豐隆穴電針針刺，可以降低血清總膽固醇水平，進(jìn)而調(diào)節(jié)血脂。中脘穴位于任脈之上，既為胃經(jīng)之募穴，又為腑會(huì)，因此可治一切腑病，尤擅胃腑之疾患，脾俞為脾經(jīng)之俞穴，益脾胃、養(yǎng)氣血、化濕濁；脾俞處于脾臟氣血注輸之地，可主脾病，具有健脾除濕、益氣通血之功。中脘與脾俞相互為用，為俞募配穴，兩者能更好的健脾和胃除濕、補(bǔ)益氣血。國(guó)內(nèi)研究表明[15]，對(duì)俞募穴進(jìn)行穴位埋線可降低高血脂患者的血脂水平。中藥選擇山楂、丹參、虎杖、荷葉以活血化瘀；以何首烏、枸杞補(bǔ)肝腎；以菊花、蟬蛻以清肝，肝清則舒，可促進(jìn)瘀血的消散與痰飲的驅(qū)逐；甘草補(bǔ)脾兼調(diào)和諸藥，諸藥與針灸合用共達(dá)補(bǔ)虛化痰、活血祛瘀之功效。

查閱大量參考文獻(xiàn)高脂飼料飼喂造模，成功率很高，同時(shí)與人發(fā)病機(jī)制相似[16-18]。SD大鼠作為模型動(dòng)物，能保證實(shí)驗(yàn)的可操作性;血脂四項(xiàng)(TC、TG、LDL-C、HDL-C)是檢測(cè)血脂水平的公認(rèn)標(biāo)準(zhǔn)[19],能保證實(shí)驗(yàn)的準(zhǔn)確性；而單存給藥是協(xié)定處方藥，能保證實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性對(duì)照組的可靠參考性[20-21]。實(shí)驗(yàn)顯示各治療均能降低TC、TG和LDL-C水平，增高HDL-C水平，微針與高劑量治療作用效果最佳。目前利用針?biāo)幏ㄖ委煾咧Y的臨床及試驗(yàn)研究相對(duì)較少，因此本次研究在未來(lái)針對(duì)高脂血癥的治療上有重要的意義。在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中遇到了諸多問(wèn)題，方劑研究涉及的是一個(gè)典型的多因素多水平問(wèn)題，筆者對(duì)藥物組合治療方案進(jìn)行優(yōu)選，篩選對(duì)比研究，其作用已經(jīng)十分清晰，所以本研究有設(shè)立調(diào)脂飲為對(duì)照組重復(fù)驗(yàn)證其作用，既具有臨床觀察證實(shí)，又存在現(xiàn)代藥理研究證據(jù)，實(shí)驗(yàn)觀察此方法還可以調(diào)節(jié)谷氨酸、天門(mén)冬氨酸及GA含量的異常升高，起到腦保護(hù)的作用。然而中藥方劑受各種因素影響，比如方劑中各種藥物的配伍劑量、君臣佐使的配伍方法均存在著非常復(fù)雜的交互作用，方劑給藥途徑有口服灌腸等，各種給藥方法也會(huì)對(duì)藥物的吸收存在影響，中醫(yī)時(shí)令服藥的給藥時(shí)間，理論上也會(huì)影響藥物的治療效果，綜上這些作用影響存在協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng)[22-24]。此次試驗(yàn)為了驗(yàn)證臨床觀察結(jié)果，筆者只是在宏觀評(píng)分及微觀分子RNA水平進(jìn)行了量化比較，仍然沒(méi)有足夠基礎(chǔ)進(jìn)行定量配伍劑量及君臣佐使的配伍方法分析，沒(méi)有足夠基礎(chǔ)對(duì)藥物間交互作用的性質(zhì)(協(xié)同效應(yīng)或拮抗效應(yīng))進(jìn)行分析，未對(duì)中藥組合之間的作用機(jī)制進(jìn)行深入探討。只是依據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)在臨床常用劑量基礎(chǔ)上調(diào)整，所以本研究只是為了改善高脂血癥的臨床療效，采用的一次初步研究，在今后的系列研究中，筆者將對(duì)本次未完成的內(nèi)容進(jìn)行更深一步的研究，期待得出更加系統(tǒng)的各種基本數(shù)據(jù)和信息，為在臨床的使用貢獻(xiàn)一份力量。