周 娜 吳成鳳 汪 丹 陳立平 潘志強(qiáng) 申 文

（1徐州醫(yī)科大學(xué)，江蘇省麻醉與疼痛應(yīng)用技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，徐州221004； 2徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院疼痛科，徐州221002）

疼痛是惡性腫瘤病人最常見的臨床表現(xiàn)之一。目前，約65%以上癌癥病人存在中重度疼痛，其中約22%存在著劇烈甚至難以忍受的疼痛[1]。臨床上有關(guān)癌痛治療的手段多種多樣，但大多不能獲得滿意的鎮(zhèn)痛療效。研究發(fā)現(xiàn)疼痛感知、疼痛敏感性和慢性疼痛易感性在個(gè)體間存在很大差異，這種差異由基因和環(huán)境因素共同決定[2]，在基因組學(xué)上可表現(xiàn)為單個(gè)堿基的突變所引起的DNA序列多態(tài)性，即單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism,SNP)。隨著基因靶向治療的不斷興起，人們正在積極尋找影響癌痛發(fā)生的相關(guān)基因位點(diǎn)，以便通過特異性干預(yù)疼痛基因位點(diǎn)SNP來治療癌痛的方案成為可能。SCN9A (sodium channel protein type 9 subunit alpha) 是編碼電壓門控鈉離子通道α-亞單位蛋白家族中的第Ⅸ型 (Nav1.7) 的基因，表達(dá)于初級(jí)感覺神經(jīng)元和交感神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元中。而電壓門控鈉離子通道 (voltage-gated sodium channels, VGSCs)的內(nèi)向電流是神經(jīng)元?jiǎng)幼麟娢划a(chǎn)生和電流傳導(dǎo)的必需環(huán)節(jié)，參與痛覺信號(hào)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)[3]。研究發(fā)現(xiàn)SCN9A基因突變會(huì)改變鈉離子通道的結(jié)構(gòu)，影響其正常功能的發(fā)揮，導(dǎo)致多種與痛覺異常相關(guān)的疾病發(fā)生[4～6]。Kurzawski等人也發(fā)現(xiàn) SCN9A-rs6746030的SNP與椎間盤突出癥病人的疼痛強(qiáng)度有關(guān)[7]，但關(guān)于rs6746030的SNP與癌痛發(fā)生的相關(guān)研究較少。為此，本研究對(duì)SCN9A-rs6746030的SNP與肺癌病人疼痛發(fā)生的相關(guān)性進(jìn)行探討，同時(shí)分析其對(duì)癌痛病人阿片藥物用量的影響，從而為揭示癌癥病人的疼痛差異及其疼痛基因靶向治療的研究提供參考。

方 法

1.一般資料

選擇2016年11月至2017年5月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院住院且病理學(xué)和/或細(xì)胞學(xué)確診為肺癌的病人246例，其中肺癌伴疼痛者128例（疼痛組：男86例、女42例，年齡32～83歲）；肺癌不伴疼痛者118例（無痛組：男73例、女45例，年齡 36～82歲）。選取同期該院的健康體檢者106例作為對(duì)照組（男54例、女52例，年齡27～75歲），所有研究對(duì)象均為漢族自然人群，且無血緣關(guān)系。三組間的年齡和性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。本研究已通過徐州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（倫理號(hào)：XYFY2015-KL002-01）。

排除標(biāo)準(zhǔn)：①曾患有或現(xiàn)有嚴(yán)重精神疾病者，或神志不清者；②合并其他疾病引起的慢性疼痛病人；③嚴(yán)重肝、腎功能損害者；④不能進(jìn)行疼痛評(píng)估者。

2.方法

（1）評(píng)估：疼痛程度評(píng)估采用數(shù)字評(píng)價(jià)量表(numerical rating scale, NRS)法： 0分為無痛、1～3分為輕度疼痛、4～6分為中度疼痛、7～10分為重度疼痛。初次疼痛評(píng)分在住院期間未使用鎮(zhèn)痛藥物之前進(jìn)行，評(píng)估結(jié)束后對(duì)癌痛病人按照歐洲癌痛阿片類藥物鎮(zhèn)痛指南用藥[8]。對(duì)中重度癌痛病人，根據(jù)其個(gè)體用藥差異情況選擇不同的鎮(zhèn)痛藥物，如：?jiǎn)岱取⒘u考酮、曲馬多及芬太尼透皮貼等。以動(dòng)態(tài)NRS≤3分為癌痛控制滿意標(biāo)準(zhǔn)。對(duì)阿片類藥物用量的統(tǒng)計(jì)采用每日等效口服嗎啡劑量 (morphine equivalent daily dose, MEDD)，即將隨訪期內(nèi)所用阿片類藥物總量換算成嗎啡等效劑量總量(mg) /總使用時(shí)間 (d)，其換算公式為曲馬多（口服）200 mg/d = 羥考酮（口服）30 mg/d = 芬太尼（貼劑）6 mg/d = 嗎啡（靜脈/皮下）20 mg/d = 嗎啡（口服）60 mg/d。

（2）基因型測(cè)定：抽取研究對(duì)象外周靜脈血樣2 ml，DNA提取采用樹脂型TM基因組DNA提取試劑盒（上海賽百盛）。PCR引物設(shè)計(jì)由上海生工公司設(shè)計(jì)，引物序列:正向引物5'-GTGGTCCTTTGGACAACAGC-3'，反向引物5'-TGGTTGA GGGAGTATCACAGAA-3'。PCR反應(yīng)體系同普通PCR擴(kuò)增，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性4 min，然后進(jìn)行35個(gè)循環(huán)（95℃變性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s），72℃終末延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)為477 bp。將PCR產(chǎn)物用限制性核酸內(nèi)切酶CviQI進(jìn)行酶切，酶切反應(yīng)體系為 PCR產(chǎn)物10 μl，10 ×buffer 5 μl，酶 1 μl，ddH2O 34 μl，總體積為 50 μl，此反應(yīng)體系置于25℃的水浴箱中酶切2 h，酶切后片段長(zhǎng)度分別為144 bp和333 bp。反應(yīng)終止后用2%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，電壓120 V，時(shí)間45 min，紫外線凝膠成像分析系統(tǒng)進(jìn)行基因分型（見圖1）。隨機(jī)抽取不同基因型DNA標(biāo)本的PCR產(chǎn)物寄送上海生工公司進(jìn)行測(cè)序（見圖2），以驗(yàn)證PCRRFLP方法基因型鑒定的準(zhǔn)確性。

圖1 rs6746030位點(diǎn)基因型凝膠電泳圖譜Fig.1 Rs6746030 genotype gel electrophoresis

圖2 rs6746030位點(diǎn)基因型測(cè)序圖Fig.2 Genotype sequencing diagram of rs6746030

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料采用X2檢驗(yàn)，分析癌痛發(fā)生相關(guān)影響因素采用logistic回歸模型，結(jié)果以比值比(odds ratio, OR)和95%可信區(qū)間(95% CI)來表示，基因型間阿片類藥物用量的比較采用Mann-Whitney檢驗(yàn)，所有P值為雙側(cè)檢驗(yàn)，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.Rs6746030位點(diǎn)的基因型及等位基因頻率分布

三組rs6746030位點(diǎn)基因型和等位基因的頻率分布均符合經(jīng)Hardy-Weinberg遺傳平衡（見表1），表明本研究的三組抽樣群體均為平衡群體，具有可比性。對(duì)無痛組和對(duì)照組基因型頻率及等位基因頻率分別進(jìn)行X2檢驗(yàn)，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 rs6746030位點(diǎn)基因型及等位基因頻率分布[n (%)]Table 1 Distributions of genotype and allele frequency of rs3746030 [n (%)]

2.SCN9A基因rs6746030多態(tài)性與肺癌疼痛之間的相關(guān)性

將全體肺癌病人作為整體進(jìn)行分析，把本研究中可能干擾肺癌病人疼痛發(fā)生的所有混雜因素包括性別、年齡、病理分型（腺癌、鱗癌、小細(xì)胞癌和其他）、TNM分期（III-II期與III-IV期）及基因型（GG與GA+AA）等對(duì)肺癌疼痛發(fā)生的影響分別進(jìn)行單因素分析，結(jié)果顯示肺癌疼痛的發(fā)生與TNM分期和基因型有顯著相關(guān)性(P＜ 0.05，P＜ 0.001)，而性別、年齡、病理分型均無差異（見表2）。

表2 影響肺癌疼痛發(fā)生的臨床病理特征單因素分析Table 2 Univariate analysis of clinicopathologic parameters of pain susceptibility in patients with lung cancer

再將TNM分期與基因型納入多因素logistic回歸分析，對(duì)肺癌疼痛組與無痛組進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，基因型GA/AA是肺癌疼痛發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P＜0.001,OR= 3.695, 95%CI = 1.883-7.253），TNM分期中III-IV期（P= 0.009,OR= 2.339, 95%CI =1.235-4.431）肺癌疼痛發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)顯著增高（見表3）。

表3 肺癌疼痛發(fā)生影響因素的多因素logistic回歸分析Table 3 Multivariate logistic regression analysis of the factors of pain susceptibility

對(duì)疼痛組III-IV期的病例按照疼痛程度（輕度、中度和重度）進(jìn)行分組來比較基因型分布與肺癌疼痛程度之間的差異，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因型分布與肺癌疼痛程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（見表4）。

表4 不同疼痛程度rs6746030位點(diǎn)基因型分布[n (%)]Table 4 Distributions of rs6746030 genotype in patients with different pain levels [n (%)]

3.SCN9A基因rs6746030多態(tài)性與阿片用藥量之間的關(guān)系

選取疼痛組Ⅲ-Ⅳ期且使用阿片類鎮(zhèn)痛藥物的病例共79例，所有阿片類藥物用量換算采用MEDD。采用Mann-Whitney檢驗(yàn),發(fā)現(xiàn)中度疼痛組和重度疼痛組不同基因型病人24 h阿片類藥物用量均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（見表5）。

表5 中、重度疼痛病人不同基因型間阿片類藥物用量比較Table 5 Comparisons of opioid doses among different genotypes of moderate and severe pain patients

討 論

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的迅速發(fā)展，從基因水平對(duì)疼痛的研究日趨熱門化。越來越多與疼痛相關(guān)的基因被發(fā)現(xiàn)并證實(shí)，包括參與痛覺傳遞及調(diào)制相關(guān)的重要離子通道基因、神經(jīng)遞質(zhì)系統(tǒng)基因及與疼痛治療相關(guān)的藥物代謝基因等[9～11]。VGSCs是細(xì)胞興奮性的基礎(chǔ)，在生物體內(nèi)廣泛的分布。VGSCs的表達(dá)異?？赡芘c炎性痛、神經(jīng)病理性痛和癌痛等多種慢性痛的發(fā)病機(jī)制相關(guān)[12,13]。SCN9A基因負(fù)責(zé)編碼電壓門控鈉通道Nav1.7的α亞基，其位于2號(hào)染色體長(zhǎng)臂上24區(qū)，其核苷酸序列由一個(gè)開放的讀碼框架組成，該讀碼序列包含有113.5kb堿基，共26個(gè)外顯子，編碼1 977個(gè)氨基酸（約225kD）[14]。目前發(fā)現(xiàn)的Nav1.7的突變點(diǎn)約有29個(gè)，多數(shù)與疼痛性疾病密切相關(guān)[4～6,14]。SCN9A-rs6746030 位于 18 號(hào)外顯子區(qū)，其上的堿基G突變?yōu)锳時(shí)，將導(dǎo)致Nav1.7第1 150處的氨基酸由精氨酸變?yōu)樯彼?R1150W)。Reimann等人發(fā)現(xiàn)SCN9A-rs6746030基因多態(tài)性與神經(jīng)病理性痛病人的疼痛嚴(yán)重程度相關(guān)，帶有A等位基因的個(gè)體，其C類神經(jīng)纖維興奮性提高而痛閾降低[15]。此外，在對(duì)人和小鼠的研究中發(fā)現(xiàn)Nav1.7不僅參與電活動(dòng)的傳導(dǎo)，而且是阿片樣物質(zhì)活性的調(diào)節(jié)劑，但是對(duì)其具體發(fā)生機(jī)制尚不清楚[16]。因此本研究對(duì)SCN9A-rs6746030基因多態(tài)性與肺癌疼痛發(fā)生的相關(guān)性及其對(duì)阿片類藥物用量的影響進(jìn)行了探討。

研究發(fā)現(xiàn)，中國(guó)漢族人群SCN9A-rs6746030位點(diǎn)基因型頻率GG/GA為0.906/0.094，等位基因頻率G/A為0.953/0.047，與PubMed (ss91428158)上公布的亞洲人群基因型頻率GG/GA為0.854/0.146，等位基因頻率G/A為0.927/0.073，兩者間分布無明顯差異。此外，研究還發(fā)現(xiàn)無痛組與對(duì)照組間基因型及等位基因的頻率分布差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此暫不認(rèn)為SCN9A-rs6746030的基因多態(tài)性與肺癌的易感性相關(guān)，以此進(jìn)一步分析其與肺癌疼痛的發(fā)生是否相關(guān)。

有研究表明癌痛發(fā)生可能與年齡、性別、疾病階段和合并癥等因素相關(guān)[17]。本研究對(duì)肺癌疼痛的發(fā)生可能存在的混雜因素如性別、年齡、病理類型、TNM分期及基因型等進(jìn)行了單因素和多因素logistic回歸分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)基因型GA/AA可能是肺癌疼痛發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一。Greenbaum等人發(fā)現(xiàn)rs6746030位點(diǎn)的突變可能會(huì)增加帕金森病人的疼痛風(fēng)險(xiǎn)[18]。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)SCN9A基因多態(tài)性與間質(zhì)性膀胱炎/膀胱疼痛綜合征、骨關(guān)節(jié)炎和術(shù)后疼痛的發(fā)生等[12,13,19]相關(guān)，與本研究結(jié)果相一致。通過電生理學(xué)方法，Reimann等研究者觀察到這種功能性突變顯著增加了鈉通道對(duì)電和化學(xué)刺激的敏感性[15]，而且影響疼痛信號(hào)背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的發(fā)射[20]，但SCN9A基因多態(tài)性對(duì)疼痛感知、疼痛敏感性及疼痛易感性的詳細(xì)作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。此外，本研究通過logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)TNM分期也是影響肺癌疼痛發(fā)生一個(gè)獨(dú)立危險(xiǎn)因素，此結(jié)果與國(guó)外的研究相一致[17,21]。

目前Amgen，Pfizer和Convergence Pharmaceuticals等藥物公司正在研究Nav1.7抑制劑來抑制或減輕疼痛，但由于這種抑制劑可能會(huì)干擾離子通道的其他亞型，從而對(duì)心臟的電生理活動(dòng)產(chǎn)生致命性的沖擊及中樞神經(jīng)系統(tǒng)的毒副作用，使其藥物研發(fā)進(jìn)程緩慢[22]。Cox等人在Nature上報(bào)道了SCN9A基因突變引起罕見的先天性無痛癥，且突變個(gè)體先天失去痛覺，但機(jī)體的其它功能完全正常[6]。因此從基因水平上研究鈉離子的鎮(zhèn)痛作用意義重大。Minett等人研究發(fā)現(xiàn)Nav1.7無效突變體在先天性無痛癥相關(guān)的鎮(zhèn)痛作用中增強(qiáng)了阿片樣物質(zhì)的信號(hào)傳導(dǎo)[16]。而本研究分析了Ⅲ和Ⅳ期肺癌疼痛病人rs6746030位點(diǎn)多態(tài)性對(duì)阿片類藥物用量的影響，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)有差異，但由于本研究入組的樣本量有限及存在性別、年齡、體重等干擾因素，導(dǎo)致此結(jié)果的準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。

綜上所述，SCN9A基因多態(tài)性可能成為影響癌痛發(fā)生的因素之一，但在SCN9A基因多態(tài)性與阿片類藥物鎮(zhèn)痛劑量的研究中未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性，上述結(jié)果還需大樣本、多中心的廣泛深入研究加以驗(yàn)證。由于癌癥病人疼痛的發(fā)生存在個(gè)體差異，未來的研究應(yīng)針對(duì)阿片類鎮(zhèn)痛藥的不同類別的反應(yīng)性是否也是由基因決定的，以便對(duì)癌痛病人制定個(gè)體化醫(yī)療方案。