鄭燕芳 ，張捷平 ，余文珍 ，王曉寧 ，陳 勇 ，林曉暉 ，牛朋納 ，李長(zhǎng)征 ，林 凡 ，林自生 ，施 紅 （.福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 50；.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 50；.福清市婦幼保健院，福建 福清 5000）

糖尿病腎病是由糖尿病微血管病變引起的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，是目前糖尿病致死致殘的主要原因。本課題組的前期研究表明，降糖中藥復(fù)方石斛合劑可以改善糖尿病病人和高脂高糖飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素誘發(fā)糖尿病大鼠的糖脂代謝紊亂［1］。水代謝紊亂是糖尿病腎病的重要病理特點(diǎn)，為了探討石斛合劑防治糖尿病腎病的部份機(jī)制，我們選用自發(fā)性糖尿病腎病動(dòng)物模型db／db小鼠作為研究對(duì)象，從調(diào)節(jié)水代謝角度初步探討石斛合劑防治糖尿病腎病的可能。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 本實(shí)驗(yàn)中采用的 db／db（C57BL／KsJ）小鼠是瘦素受體點(diǎn)突變導(dǎo)致瘦素信號(hào)通路障礙，從而導(dǎo)致小鼠出現(xiàn)肥胖、胰島素抵抗、高血糖、脂肪肝等癥狀。db／db小鼠出生后6周即可出現(xiàn)明顯的肥胖和空腹血糖增加，飲水量、尿量增加，8～12周時(shí)最明顯，并可出現(xiàn)糖尿病腎病等并發(fā)癥。db／db小鼠通常以db／m小鼠作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。選取db／db 小鼠 32 只，SPF 級(jí)，體質(zhì)量平均為（42.6±3.1）g；db／m 小鼠 8 只，體質(zhì)量平均為（24.2±1.4）g。 所有小鼠均為雄性，11～12周齡，由北京大學(xué)（醫(yī)學(xué)部）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，許可證號(hào)為SCXK（京）2011-0012，飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)環(huán)境。實(shí)驗(yàn)期間，普通飼料喂養(yǎng)，自由飲食進(jìn)水，環(huán)境條件為溫度22～25℃，空氣流通，相對(duì)濕度60%～70%，12 h光照維持，晝夜循環(huán)。

1.2 藥物、試劑及儀器 石斛合劑（石斛、黃芪、丹參、葛根、五味子、生地黃、川牛膝、知母、地龍、白花蛇舌草等），六味地黃丸（熟地黃、山茱萸、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉）購(gòu)自福建中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)醫(yī)堂，本實(shí)驗(yàn)室采用水提醇沉法制備，濃縮成1.2 g生藥／mL的藥液。

BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自杭州碧云天生物技術(shù)有限公司，AQP2、AQP3兔抗鼠一抗和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。電泳儀、BIO-RAD凝膠成像儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法 db／db小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按空腹血糖（FBG）及體質(zhì)量分成4組，分別為模型組、石斛合劑低劑量組和高劑量組、六味地黃丸組、每組8只。另取同周齡表現(xiàn)正常的db／m小鼠8只為正常組。以上各組動(dòng)物分別灌胃給藥，正常組和模型組小鼠給予生理鹽水 20 mL／（kg／d），六味地黃丸組給予六味地黃丸 20 g／（kg·d），石斛合劑低劑量組和高劑量組分別給予石斛合劑6 g／（kg／d）、12 g／（kg／d）灌胃，每天 1 次，連續(xù)給藥 8 周。

1.3.1 血清學(xué)指標(biāo)測(cè)定 干預(yù)第0周、4周、8周，采用割尾法取血，以魚(yú)躍（悅好I型）血糖儀快測(cè)各組空腹血糖（FBG）；干預(yù)8周后，摘眼球采血，分離血清，采用酶法測(cè)定血清肌酐（Scr）、尿素氮（BUN）。

1.3.2 腎組織病理變化 干預(yù)8周后，處死小鼠，取左側(cè)腎臟標(biāo)本，按常規(guī)方法固定、脫水、包埋，切片厚5 μm，HE染色后于顯微鏡下觀察腎組織的病理變化。

1.3.3 免疫熒光法檢測(cè)腎組織中的AQP2、AQP3的蛋白表達(dá) 1.2.3中制備的腎臟標(biāo)本切片后，采用免疫熒光法檢測(cè)腎組織中的AQP2、AQP3的蛋白表達(dá)情況。

1.3.4 Western Blot檢測(cè)腎組織中的 AQP2、AQP3的蛋白表達(dá) 各組小鼠的右側(cè)腎臟標(biāo)本進(jìn)行總蛋白提取，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度，變性電泳后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，分別加一抗（AQP2，AQP3兔抗鼠抗體1∶200）、二抗（辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔1∶2000），用 ECL 發(fā)光、顯影，最后用 BIO－RAD 凝膠成像儀測(cè)定條帶的光密度。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料屬于正態(tài)分布的用單因素方差分析，非正態(tài)分布的用秩和檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 干預(yù)前后各組F BG變化比較 見(jiàn)表1。

表1 干預(yù)前后各組FBG變化比較（）mmol／L

表1 干預(yù)前后各組FBG變化比較（）mmol／L

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.05，3） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑低劑量組石斛合劑高劑量組六味地黃丸組n 8 8 7 8 6干預(yù)第0周5.30±0.55 16.70±3.561）18.70±2.971）14.93±3.871）18.03±4.611）干預(yù)第4周4.86±0.60 18.29±4.24 16.47±2.14 13.24±1.773）16.47±3.29干預(yù)第8周4.931±0.44 18.74±3.61 15.13±1.982）11.28±1.843）14.22±2.792）

2.2 干預(yù)8周后各組Scr和BUN比較 見(jiàn)表2。

表2 干預(yù)8周后各組Scr和BUN比較（）

表2 干預(yù)8周后各組Scr和BUN比較（）

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正常組模型組石斛合劑低劑量組石斛合劑高劑量組六味地黃丸組n 8 8 7 8 6 Scr／（μmol／L-1）83.53±10.46 216.80±31.661）135.40±10.382）104.10±7.182）118.40±11.162）BUN／（mmol／L）5.34±0.64 13.51±3.661）8.72±1.192）6.63±0.582）6.58±0.942）

2.3 各組腎臟病理變化 由圖1可見(jiàn)：HE染色后，光鏡下可見(jiàn)正常組腎組織結(jié)構(gòu)清晰，腎小球大小、形態(tài)及腎小球囊腔間隙均正常，系膜基質(zhì)正常；模型組腎小球系膜基質(zhì)增多，系膜區(qū)增寬，部分毛細(xì)血管腔狹窄，大量紅細(xì)胞淤積，腎小管細(xì)胞體積增大，管腔狹窄；石斛合劑組較模型組有明顯改善。

2.4 各組腎臟AQP2、AQP3表達(dá)變化 由圖2和圖3可知：模型組腎臟AQP2、AQP3的蛋白表達(dá)較正常組顯著升高，石斛合劑高劑量組腎臟AQP2、AQP3蛋白表達(dá)較模型組有明顯降低。說(shuō)明糖尿病腎病小鼠體內(nèi)存在水代謝紊亂，腎臟AQP2、AQP3表達(dá)異常增多，石斛合劑可能通過(guò)調(diào)節(jié)AQP2、AQP3的表達(dá)，調(diào)節(jié)體內(nèi)水代謝平衡，從而起到防治早期糖尿病腎病的作用。

圖1 各組腎臟病理變化（×400）

3 討 論

3.1 糖尿病腎病是糖尿病發(fā)展到后期階段腎臟功能衰竭導(dǎo)致的一系列病理癥狀，早期糖尿病腎病的中醫(yī)辨證以氣陰兩虛為主，并可挾水濕、濕熱、氣滯、瘀血等［2］。施紅教授經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期臨床實(shí)踐，根據(jù)糖尿病的病機(jī)特點(diǎn)，創(chuàng)立了滋陰清熱、益氣活血通絡(luò)、補(bǔ)益脾腎的石斛合劑方［3］。前期研究表明：石斛合劑能減少2型糖尿病模型動(dòng)物胰島細(xì)胞凋亡，促進(jìn)胰島素分泌，降低血糖血脂，改善腎功能，減輕2型糖尿病患者胰島素抵抗作用［4-5］。

3.2 db／db小鼠是美國(guó) Jackson實(shí)驗(yàn)室從C57BL／6J小鼠中篩選的瘦素受體基因缺陷的突變系，具有自發(fā)形成2型糖尿病的特性，其發(fā)病過(guò)程與人類(lèi)2型糖尿病非常相似。該小鼠出生約1個(gè)月后逐漸出現(xiàn)肥胖、高血糖、高血脂、糖尿等糖尿病癥狀，至出生后約2個(gè)月，開(kāi)始出現(xiàn)糖尿病腎病癥狀，是研究2型糖尿病腎病理想的動(dòng)物模型［6］。

3.3 石斛合劑對(duì)db／db小鼠腎功能的影響 Scr與BUN反映腎小球的濾過(guò)功能，當(dāng)腎小球功能受損達(dá)50%以上時(shí)，血清肌酐與尿素氮出現(xiàn)升高。本次實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)：19～20周 db／db小鼠血清尿素氮與肌酐明顯升高，表明腎功能明顯損傷；石斛合劑的干預(yù)，能夠有效降低db／db小鼠血清尿素氮與肌酐，具有防治糖尿病腎病的功效。

圖2 各組腎臟AQP2、AQP3表達(dá)（×100）

圖3 各組腎臟AQP2、AQP3表達(dá)

3.4 石斛合劑對(duì)db／db小鼠腎臟水通道蛋白的影響 AQP2主要作用是維持機(jī)體水平衡，參與尿液濃縮和滲透壓調(diào)節(jié)［7］。糖尿病患者多尿和水腫現(xiàn)象與水通道蛋白的作用密切相關(guān)，已有實(shí)驗(yàn)證明在糖尿病動(dòng)物模型中AQP2的表達(dá)顯著上調(diào)［8］，與本實(shí)驗(yàn)顯示結(jié)果一致。AQP3除調(diào)節(jié)腎臟集合管主細(xì)胞水分重吸收及尿液濃縮外，還介導(dǎo)機(jī)體甘油、尿素等小分子物質(zhì)的代謝，對(duì)終尿量形成起重要作用。當(dāng)其表達(dá)產(chǎn)生異常時(shí)會(huì)導(dǎo)致尿液濃縮障礙，產(chǎn)生多飲、多尿現(xiàn)象。但糖尿病對(duì)AQP3表達(dá)的影響目前尚存在爭(zhēng)論，有研究發(fā)現(xiàn)在STZ誘導(dǎo)的糖尿病大鼠腎臟內(nèi)髓中，AQP3的表達(dá)明顯上調(diào)，而在STZ誘導(dǎo)的糖尿病小鼠的研究中發(fā)現(xiàn) AQP3的表達(dá)下調(diào)［9-10］，而本實(shí)驗(yàn)中AQP3的蛋白表達(dá)也是上調(diào)的。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知：db／db小鼠呈現(xiàn)高血糖、腎功能障礙，說(shuō)明早期糖尿病腎病小鼠模型已經(jīng)建立；模型組AQP2、AQP3的蛋白表達(dá)增多，石斛合劑可下調(diào)AQP2、AQP3的異常高表達(dá)，最終達(dá)到改善小鼠血糖和腎功能的作用，表明石斛合劑防治早期糖尿病腎病的作用可能與調(diào)節(jié)水代謝相關(guān)。

由于糖尿病腎病的發(fā)生除了與水代謝相關(guān)外，還和高胰島素血癥、高脂血癥、脂毒性、氧化應(yīng)激、腎血流動(dòng)力學(xué)改變等多因素密切相關(guān)，故中藥石斛合劑改善腎功能所涉及的分子藥理機(jī)制還有待進(jìn)一步深入研究。