高秀容，許小紅，楊恒博，張旭，李望，汪少

(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，成都 610083)

丹參(RadixetRhizomaSalviae Miltiorrhiza)為唇型科植物丹參的干燥根及根莖，作為活血化瘀藥有悠久的臨床應(yīng)用歷史，具有祛疲止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效[1]。大量研究證實(shí)，丹參主要含有脂溶性和水溶性兩大類成分，隱丹參酮、丹參酮Ⅰ及丹參酮ⅡA為脂溶性成分，是丹參中含量最高也是最具代表性的主要成分，丹參藥材中丹參酮ⅡA含量較高，為0.1%～0.9%，因而丹參酮ⅡA曾經(jīng)一直作為丹參有效成分的質(zhì)量控制指標(biāo)，在《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版中也以丹參酮ⅡA為丹參藥材和丹參注射液的定性定量控制標(biāo)準(zhǔn)[2-3]。

目前，以脂溶性有效成分為主入藥的丹參口服制劑品種有復(fù)方丹參滴丸、丹參酮片、丹參酮膠囊、丹參酮油、丹參舒心膠囊、丹參舒心片和精制冠心片等[4]。體外溶出行為是口服制劑處方工藝篩選的重要指標(biāo)，也是有效控制制劑質(zhì)量的重要指標(biāo)。而丹參脂溶性成分的低水溶性是影響口服固體制劑溶出度的一個(gè)重要因素，從而影響丹參口服生物利用度[5-8]，筆者以丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮為指標(biāo)成分，建立了高效液相色譜(HPLC)法同時(shí)測(cè)定丹參提取物中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮含量的方法，考察了丹參脂溶性成分的體外溶出行為，篩選其體外溶出條件，以期為丹參脂溶性成分口服制劑的研究開發(fā)提供參考。

1 儀器與試藥

1.1儀器 戴安高效液相色譜儀(美國(guó)，Dionex UltiMate3000，包括四元高壓液相泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、紫外檢測(cè)器)；色譜軟件(戴安液相層析儀軟件Chromeleon 7.1)；電子天平(德國(guó) Sartorius，型號(hào)：BS 224S，感量：0.01 mg)；離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號(hào)：TGL-16G)；超聲清洗器(天津市奧特賽斯儀器有限公司，型號(hào)：AS5150BD)；純水儀(優(yōu)普超純科技公司，型號(hào)：UPT)；電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司，型號(hào)：DHG-9013A)；溶出儀(天津市國(guó)銘醫(yī)藥設(shè)備有限公司，型號(hào)：RC-6)。

1.2試藥 丹參酮Ⅰ對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號(hào)：110867-201607)；丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號(hào)：110766-201520)；隱丹參酮對(duì)照品(中國(guó)食品藥品檢定研究院，含量：99.0%，批號(hào)：110852-200806)；丹參提取物(陜西慈緣生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：20140401，20140402，20140413)；十二烷基硫酸鈉(SDS，成都市科龍化工試劑廠，分析純)；磷酸二氫鉀(成都市科龍化工試劑廠，分析純)；甲醇(迪馬公司，色譜純)；乙腈(迪馬公司，色譜純)；無水甲酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；其他試劑為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件 采用Agilent HC-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)色譜柱；流動(dòng)相：A(0.1%甲酸)，B(乙腈)，采用梯度洗脫，洗脫順序?yàn)椋?～30 min，5%→55% B；>30～40 min，55%→75% B；>40～50 min，75% B；>50～55 min，75%→5% B；流速1.0 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)286 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣體積10 μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取干燥至恒重的各對(duì)照品適量于5 mL棕色量瓶，甲醇定容，得到貯備液備用。取各儲(chǔ)備液適量于25 mL量瓶，甲醇定容得到各對(duì)照品的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，其中各對(duì)照品濃度分別為丹參酮Ⅰ93.00 μg· mL-1，丹參酮ⅡA 82.50 μg· mL-1，隱丹參酮57.50 μg· mL-1，冷藏、避光備用。

2.3供試品溶液的制備 精密稱取一定量丹參提取物至10 mL 量瓶?jī)?nèi)，加入一定量甲醇，超聲使其完全溶解，10 000 r·min-1(r=8.0 cm)離心5 min以除去不溶物，甲醇定容后，上清液經(jīng)孔徑0.22 μm 微孔濾膜濾過后進(jìn)樣。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1方法專屬性考察 按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別取空白甲醇溶液、對(duì)照品溶液和供試品溶液，記錄色譜圖(圖1)，丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮保留時(shí)間分別約為39，40和46 min，丹參酮Ⅰ和丹參酮ⅡA分離度為1.2，隱丹參酮分離度大于1.5。可見，空白溶液對(duì)各成分無干擾，各成分與雜質(zhì)峰分離度較好。

2.4.2線性關(guān)系考察 取“2.2”項(xiàng)配制的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，用甲醇依次稀釋，得以下混合標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液：丹參酮Ⅰ標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為93.00，46.50，23.25，11.63，5.81，2.91，1.45 μg· mL-1，丹參酮ⅡA標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為82.50，41.25，20.63，10.31，5.16，2.58，1.29 μg· mL-1，隱丹參酮標(biāo)準(zhǔn)曲線濃度為57.50，28.75，14.38，7.19，3.59，1.80，0.90 μg· mL-1。 按“2.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣20 μL，以色譜峰面積(Y) 對(duì)藥物濃度(X)進(jìn)行線性回歸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

丹參酮Ⅰ回歸方程為Y=0.202 3X+0.296 7(R2=0.999 2)，線性范圍1.45～93.00 μg· mL-1；丹參酮ⅡA回歸方程為Y=0.445 6X+0.527 2(R2=0.999 4)，線性范圍1.29～82.50 μg· mL-1；隱丹參酮回歸方程為Y=0.131 8X+0.000 2(R2=1.000)，線性范圍0.90～57.50 μg· mL-1。結(jié)果表明各標(biāo)準(zhǔn)品在考察濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.3精密度實(shí)驗(yàn) 取高、中、低濃度混合對(duì)照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、中、低濃度分別為46.50，11.63，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高中低濃度分別為41.25，10.31，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、中、低濃度分別為28.75，7.19，1.80 μg· mL-1，在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣5次，記錄峰面積，分別計(jì)算峰面積的RSD。 結(jié)果丹參酮Ⅰ高、中、低濃度的峰積RSD分別為0.36%，0.54%，0.55%；丹參酮ⅡA高中低濃度的峰面積RSD分別為0.50%，0.14%，0.32%；隱丹參酮高中低濃度的峰面積RSD 分別為0.66%，0.28%，0.45%；說明各成分精密度良好。

A.空白甲醇溶液；B.對(duì)照品溶液；C.供試品溶液；1.丹參酮Ⅰ；2.丹參酮ⅡA；3.隱丹參酮

圖13種溶液的HPLC圖譜

A.methanol solution；B.reference solution ；C.sample solution；1.tanshinoneⅠ；2 tanshinonⅡA；3.cryptotanshinone

Fig.1HPLCchromatogramsofthreekindsofsolution

2.4.4穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 取兩種濃度混合對(duì)照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、低濃度分別為46.50，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高、低濃度分別為41.25，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、低濃度分別為28.75，1.80 μg· mL-1，將該混合對(duì)照品溶液置于37 ℃恒溫水浴鍋中，于0，2，4，6，8，12，24，36 h取樣，在上述色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果丹參酮Ⅰ高、低濃度RSD分別為1.15%，1.02%；丹參酮ⅡA高、低濃度RSD分別為1.01%，0.66%；隱丹參酮高、低濃度RSD分別為0.65%，1.16%，可見，各成分在37 ℃下36 h穩(wěn)定。

2.4.5加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的提取物，精密稱定27份，分成9組，每組3份。分別加入高、中、低濃度的混合對(duì)照品溶液，其中丹參酮Ⅰ高、中、低濃度分別為46.50，11.63，2.91 μg· mL-1，丹參酮ⅡA高、中、低濃度分別為41.25，10.31，2.58 μg· mL-1，隱丹參酮高、中、低濃度分別為28.75，7.19，1.80 μg· mL-1，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在上述色譜條件下測(cè)定。結(jié)果丹參酮Ⅰ高、中、低濃度平均加樣回收率為(99.85±0.034)%(n=3)，丹參酮ⅡA高、中、低濃度平均加樣回收率為(100.35±0.019)%(n=3)，隱丹參酮高、中、低濃度平均加樣回收率為(100.74±0.026)%(n=3)，符合要求。

2.5丹參提取物中各成分含量測(cè)定 取3個(gè)批號(hào)丹參提取物，每個(gè)批號(hào)分別按“2.3”項(xiàng)下方法平行制備3個(gè)樣品，進(jìn)行含量測(cè)定，在上述色譜條件下測(cè)定，記錄色譜峰面積，按外標(biāo)法計(jì)算各成分的含量，結(jié)果見表1。

表1丹參提取物中各成分含量測(cè)定結(jié)果

提取物批號(hào)丹參酮Ⅰ丹參酮ⅡA隱丹參酮201404010.332±0.0540.954±0.0680.544±0.010201404020.345±0.0330.886±0.0740.532±0.021201404130.310±0.0120.827±0.0510.478±0.038

2.6提取物中各成分體外溶出行為考察 溶出條件：由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，故選擇《中華人民共和國(guó)藥典》收載的第三法(小杯法)進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)。釋放介質(zhì)體積為250 mL，為純水或不同pH值緩沖液，溶出溫度為(37.0±0.5)℃，取樣時(shí)間點(diǎn)為0，2，4，6，8，10，12 h，每次吸取溶出液3 mL，取出后及時(shí)補(bǔ)加新鮮空白溶出介質(zhì)3 mL，溶出液以孔徑0.45 μm濾膜過濾，續(xù)濾液用HPLC法進(jìn)行測(cè)定。

2.6.1SDS對(duì)丹參提取物成分溶出行為的影響 對(duì)于水溶性較差的藥物，可在釋放介質(zhì)中加入表面活性劑促進(jìn)藥物溶出[5]，故本實(shí)驗(yàn)考察了0.0%，0.3%，0.5%，0.7%和0.9% SDS對(duì)丹參脂溶性成分丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮溶出行為的影響。釋放介質(zhì)為pH值6.8磷酸鹽緩沖液，轉(zhuǎn)速75 r·min-1，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2～4。

由圖2～4可知，當(dāng)溶出液中不加入SDS時(shí)(即SDS濃度0.0%)，溶出液中未能檢測(cè)上述3種成分；隨著溶出液中SDS濃度增加，3種脂溶性成分溶出度逐漸增加，可見SDS對(duì)上述3種成分溶出行為有顯著影響。由于一般要求溶出介質(zhì)中SDS濃度<0.5%，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中選擇SDS濃度為0.5%繼續(xù)進(jìn)行考察。

圖2 不同濃度SDS對(duì)丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.2EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖3 不同濃度SDS對(duì)丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.3EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖4 不同濃度SDS對(duì)隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.4EffectofdifferentconcentrationsofSDSonthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

2.6.2不同pH值對(duì)丹參提取物溶出行為的影響 考察丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮在純化水、pH值4.0、pH值6.8和pH值7.4磷酸鹽緩沖液中的溶出行為。釋放介質(zhì)SDS濃度為0.5%、轉(zhuǎn)速75 r·min-1時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖5～7。

由圖5～7可知，溶出介質(zhì)的pH值對(duì)丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的溶出行為無顯著影響，美國(guó)食品藥品管理局(FDA)規(guī)定，以pH值6.8與人體腸液相似，此pH值更符合藥物經(jīng)口服后的體內(nèi)環(huán)境[9]，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中采用pH值6.8磷酸鹽緩沖液為溶出介質(zhì)。

圖5 不同pH值溶出液對(duì)丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.5EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖6 不同pH值溶出液對(duì)丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.6EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖7 不同pH值溶出液對(duì)隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.7EffectofdifferentpHsolutiononthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

2.6.3轉(zhuǎn)速的影響 由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，本實(shí)驗(yàn)采用提高溶出儀轉(zhuǎn)速的方法提高其溶出度，分別考察3種成分在50，75和100 r·min-1條件下的溶出行為，結(jié)果見圖8～10。

由圖8～10可知，溶出儀轉(zhuǎn)速對(duì)丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA和隱丹參酮的溶出行為無顯著影響，說明這3種成分的溶出特性受釋放介質(zhì)流動(dòng)狀態(tài)影響較小。

3 討論

由于丹參3種脂溶性成分結(jié)構(gòu)相似，尤其是隱丹參酮和丹參酮，所以HPLC很難將二者達(dá)到基線分離，所以本實(shí)驗(yàn)采用梯度洗脫的方法，最終分離度良好，成功對(duì)三者進(jìn)行分析。

圖8 不同轉(zhuǎn)速對(duì)丹參酮Ⅰ溶出行為的影響

Fig.8EffectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehavioroftanshinoneⅠ

圖9 不同轉(zhuǎn)速對(duì)丹參酮ⅡA溶出行為的影響

Fig.9EffectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehavioroftanshinonⅡA

圖10 不同轉(zhuǎn)速對(duì)隱丹參酮溶出行為的影響

Fig.10Effectofdifferentrotationalspeedonthedissolutionbehaviorofcryptotanshinone

由于丹參脂溶性成分均為水難溶性成分，在溶出介質(zhì)中濃度較低，故選擇《中華人民共和國(guó)藥典》2015年版收載的第三法——小杯法進(jìn)行溶出實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法適宜作為丹參脂溶性成分溶出行為的研究。

在實(shí)驗(yàn)中，曾考察除SDS之外的其他表面活性劑對(duì)丹參3種脂溶性成分的溶出行為的影響，如聚山梨酯-80，結(jié)果顯示聚山梨酯-80對(duì)3種成分溶出行為無影響(數(shù)據(jù)未列出)，最終篩選出SDS為作為溶出介質(zhì)。

本實(shí)驗(yàn)以丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮為丹參脂溶性成分的指標(biāo)成分，成功建立了HPLC方法同時(shí)測(cè)定丹參提取物中丹參酮Ⅰ、丹參酮ⅡA及隱丹參酮含量，考察了丹參脂溶性成分的體外溶出行為，篩選其體外溶出條件，為丹參脂溶性成分口服制劑的研究開發(fā)提供研究基礎(chǔ)。