沈倩，劉勇，于世英

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤科，武漢 430030；2.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬徐州醫(yī)院/徐州市中心醫(yī)院腫瘤科，徐州 210000)

乳腺癌是危害女性生命的最常見腫瘤，近年來發(fā)病率不斷上升。 人類表皮因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2，HER2)是一個重要的原癌基因，編碼具有酪氨酸激酶活性的跨膜受體樣蛋白[1]。HER2基因擴(kuò)增導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞表面HER2蛋白表達(dá)增加，從而使HER2受體活化[2]。在原發(fā)性乳腺癌患者中有25%～30%患者HER2過度表達(dá)[3]。目前研究表明，HER2是重要的乳腺癌預(yù)后判斷因子，HER2過表達(dá)與乳腺癌侵襲轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，而且往往提示乳腺癌患者預(yù)后不佳[4]。曲妥珠單抗(trastuzumab)是一種人源化單克隆抗體，靶向作用于HER2受體，致使腫瘤細(xì)胞在G1階段的生長終止，可以有效地抑制HER2過表達(dá)腫瘤細(xì)胞的增殖，是HER2過表達(dá)乳腺癌的最有效靶向治療方式[5]。 盡管如此，對曲妥珠單抗的原發(fā)或繼發(fā)耐藥現(xiàn)象仍是臨床上乳腺癌治療的一大難題[6-8]。 目前研究顯示， Jab1/CSN5(Jun activating binding protein) 作為COP9信號體的第5個亞單位，在乳腺癌、卵巢癌、肝癌、頭頸部腫瘤等實體腫瘤中發(fā)揮重要作用。筆者檢測正常組織和乳腺癌組織中Jab1表達(dá)水平，分析其與臨床病理特征的相關(guān)性，利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)敲除乳腺癌細(xì)胞中Jab1，觀察Jab1對于導(dǎo)致HER2過表達(dá)乳腺癌對曲妥珠單抗治療敏感性的影響。

1 材料與方法

1.1材料 人正常乳腺組織和乳腺癌組織標(biāo)本來源于華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院病理科。人乳腺癌細(xì)胞(BT474、C5、C6)由華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院腫瘤中心實驗室保存。達(dá)爾伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM/G)及RPMI 1640培養(yǎng)基購自Hyclone ；胎牛血清、胰蛋白酶購自Gibco公司，曲妥珠單抗(Ttzm，赫賽汀，Roche公司)，RIPA裂解液、LipofectamineTM3000脂質(zhì)體(Invitmgen公司)，抗體Jab1及二抗(Santa Cruz公司)；Jab1 siRNA由Ambion公司合成。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)和Jab1 siRNA轉(zhuǎn)染 BT474細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM/G培養(yǎng)基；人曲妥珠單抗耐藥乳腺癌細(xì)胞系C5、C6培養(yǎng)于含有10%胎牛血清及2 μg·mL-1曲妥珠單抗的DMEM/G培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。根據(jù)LipofectamineTM2000說明書，將BT474和SKBR3以2×105·mL-1密度接種6孔板，每個細(xì)胞系分為兩組：①轉(zhuǎn)染空白siRNA的對照組；②轉(zhuǎn)染Jab1 siRNA的實驗組，每組分別使用100 pmol siRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞6 h后，換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞進(jìn)行相應(yīng)實驗。

1.33-(4，5-二甲基吡啶-2-基)-5-(3-羧基甲氨基苯基)-2-(4-磺苯基-2H-四唑)(MTS)實驗檢測曲妥珠單抗在乳腺癌細(xì)胞系中對細(xì)胞增殖的影響 MTS實驗分為兩部分，第一部分驗證乳腺癌細(xì)胞系BT474及曲妥珠耐藥株C5和C6的藥物敏感性；第二部分檢測Jab1敲低后，C5和C6耐藥株對曲妥珠單抗敏感性的影響，每個細(xì)胞系分為兩組：siNC空白組及Jab1 siRNA組，依據(jù)“1.2”項中實驗步驟轉(zhuǎn)染24 h后，用不同梯度濃度的曲妥珠單抗處理細(xì)胞。 兩部分實驗的藥物處理時間均為72 h，藥物梯度為12.5，25，50，100，200 μg·mL-1藥物處理完畢后，用MTS法檢測每孔中的細(xì)胞活性，計算并制作曲妥珠單抗的生長抑制曲線，并計算半數(shù)抑制濃度(IC50)。

1.4Annexin V/PI 雙染法檢測細(xì)胞凋亡 取對數(shù)生長期細(xì)胞，消化計數(shù)后，將耐藥株C5和C6細(xì)胞以細(xì)胞密度為2.5×105·mL-1接種于直徑6 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，每個細(xì)胞系的實驗分組如下：①空載體siRNA+二甲亞砜(DMSO)組；②空載體siRNA+曲妥珠單抗組；③Jab1 siRNA+DMSO組；④Jab1 siRNA+曲妥珠單抗組。第2天細(xì)胞貼壁后，依照“1.2”項所述，行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，24 h后，依分組加入5 μg·mL-1曲妥珠單抗或?qū)?yīng)體積的DMSO，處理24 h后，收集每組中含有上清液里細(xì)胞的全部細(xì)胞，1000 r·min-1離心3 min，吸棄上清液，加入磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸漂洗細(xì)胞，再次以1000 r·min-1離心3 min，吸棄上清液PBS，加入凋亡抗體反應(yīng)緩沖液100 μL，然后加入Annexin V 5 μL，于室溫下避光反應(yīng)5～10 min，于上機(jī)前加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)400 μL，用流式細(xì)胞儀檢測每組中的凋亡細(xì)胞比例，其中Annexin V陽性/PI陰性的細(xì)胞為早期凋亡細(xì)胞，Annexin V陽性/PI陽性的細(xì)胞則為晚期凋亡細(xì)胞，統(tǒng)計這兩部分細(xì)胞在整體細(xì)胞中的比例作為該組的凋亡率。

1.5定量聚合酶鏈反應(yīng)(q-PCR)實驗檢測乳腺癌組織標(biāo)本中Jab1表達(dá) 按流程提取RNA，并逆轉(zhuǎn)成cDNA，在PCR儀上完成q-PCR，實驗條件：變性溫度為95 ℃，退火溫度為55 ℃，Jab1引物序列如下：F：5′-GCAATCGGGTGGTATCATAGC-3′；R：5′-TGCGGATA-TTGTTCTTGTTGGA-3′，完成PCR取得每個標(biāo)本CT值后，取曲妥珠單抗敏感中1例乳腺癌組織當(dāng)做對照組，其Jab1表達(dá)記為1，依照公式：其他組織表達(dá)量倍數(shù)=2-△Ct，其中△Ct =其他組織CT值-對照組CT值，計算完畢后，使用Graphpad Prism 5.0制圖，并計算兩組間Jab1表達(dá)量的差異。

1.6Western blotting 檢測Jab1水平 RIPA裂解液提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度。每個樣本取30 μg蛋白進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)電泳，轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用5%脫脂乳封閉1 h，4 ℃一抗孵育過夜(Jab1 1：1000、β-actin 1：1000)。磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗滌3×10 min，室溫二抗孵育1 h(1：3000)。PBST洗滌3×10 min，增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)法顯色后顯影成像，以β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1Jab1在曲妥珠單抗耐藥及敏感乳腺癌組織中的表達(dá) 26例使用曲妥珠單抗治療的乳腺癌患者組織q-PCR結(jié)果顯示，在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌組織中Jab1的表達(dá)水平顯著高于敏感的乳腺癌組織(圖1)，耐藥組中Jab1表達(dá)的平均值為敏感組的2.1倍(t=3.564，P<0.01)。

圖1 Jab1在乳腺癌患者中表達(dá)情況

2.2Jab1在乳腺癌細(xì)胞株中的表達(dá) Western blotting檢測結(jié)果顯示Jab1在曲妥珠單抗耐藥株乳腺癌細(xì)胞C5、C6中的表達(dá)水平顯著高于曲妥珠單抗敏感乳腺癌細(xì)胞系BT474(圖2)，灰度值分析顯示，C5和C6細(xì)胞系中Jab1在蛋白水平的表達(dá)分別是BT474細(xì)胞的18.3和15.1倍。

圖2 Jab1在乳腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)

Fig.2Jab1expressioninbreastcancercelllines

2.3Jab1敲除對曲妥珠單抗耐藥性的影響 Western blotting檢測結(jié)果顯示，Jab1 siRNA 能夠顯著降低C5及C6細(xì)胞系中Jab1的表達(dá)(圖3)，灰度值分析顯示C5細(xì)胞系中，Jab1 siRNA 組中Jab1的表達(dá)為對照組的23.5%，而C6細(xì)胞系中，Jab1 siRNA組為對照組的45.6%。MTS結(jié)果顯示，Jab1敲除后對曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細(xì)胞株系C5 和C6重新對曲妥珠單抗敏感(P<0.05)(圖4)。

2.4Jab1敲除對曲妥珠單抗治療誘導(dǎo)的凋亡的影響 Annexin V/PI 染色結(jié)果顯示，在Jab1敲除后的細(xì)胞系C5和C6，曲妥珠單抗導(dǎo)致的凋亡作用顯著增強(qiáng)，在C5細(xì)胞系中，100 μg·mL-1曲妥珠單抗處理24 h后，Jab1敲除組與對照組凋亡率為(12.8±2.9)% 和(2.7±0.5)%(P<0.05)(圖5)。而在C6細(xì)胞系中，Jab1敲除組與對照組的凋亡率分別為(18.8±3.6)% 和(4.1±1.1)%(P<0.05)(圖6)。

圖3 敲除后Jab1在C5和C6中的表達(dá)

Fig.3Jab1expressioninC5cellsandC6cellsafterJab1knockdown

圖4 Jab1敲除后對C5和C6細(xì)胞存活率的影響

Fig.4ViabilityofC5cellsandC6cellsafterJab1knockdown

圖5 Jab1敲除后對C5細(xì)胞凋亡的影響

Fig.5ApoptosisrateofC5cellsafterJab1knockdown

3 討論

HER2是乳腺癌重要的預(yù)后判斷因子，目前以HER2為靶點藥物曲妥珠單抗在大部分HER2陽性的乳腺癌患者中取得了良好的療效，改善了預(yù)后，但是在治療過程中大部分患者發(fā)生了曲妥珠單抗耐藥的情況，這也是目前乳腺癌治療研究中的熱點與難點。在乳腺癌中，HER2的過表達(dá)能夠激活一些重要的信號通路，如MAPK及PI3K/AKT信號通路等，這些重要信號通路的激活能夠促進(jìn)腫瘤的增殖及侵襲?；诖爽F(xiàn)象，通過抑制這些重要通路來逆轉(zhuǎn)曲妥珠單抗耐藥取得了進(jìn)展，動物實驗及前期臨床試驗表明，以這些信號通路為靶點的藥物聯(lián)合曲妥珠單抗在HER2乳腺癌治療中取得了一定療效，但對HER2過表達(dá)乳腺癌曲妥珠單抗耐藥的進(jìn)一步研究仍然是必要的。Jab1/CSN5是COP9信號體的第5個亞單位，在許多惡性腫瘤組織中過表達(dá)的現(xiàn)象，包括乳腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、膠質(zhì)瘤等，實驗表明，Jab1對這些腫瘤的增殖及侵襲性有顯著影響，因此Jab1在很多腫瘤中認(rèn)為是一個潛在的治療靶點，此外，HER2能夠在轉(zhuǎn)錄水平激活Jab1從而在諸多腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用[9]。在乳腺中，HER2是重要的治療靶點，HER2和Jab1的聯(lián)系使得筆者做了大膽的假設(shè)，并研究Jab1在曲妥珠單抗耐藥中是否發(fā)揮一定的作用。本研究結(jié)果顯示，Jab1在曲妥珠單抗耐藥乳腺癌患者組織中表達(dá)顯著高于曲妥珠單抗敏感乳腺癌患者，同樣的，在曲妥珠單抗耐藥的乳腺癌細(xì)胞株C5和C6中，Jab1蛋白表達(dá)水平顯著高于敏感組細(xì)胞株。這提示Jab1可能作為預(yù)測HER2過表達(dá)乳腺癌對于曲妥珠單抗治療敏感性的有效預(yù)測指標(biāo)。進(jìn)一步利用RNA干擾技術(shù)敲除耐藥細(xì)胞株中Jab1的表達(dá)，可見細(xì)胞株IC50明顯下降。凋亡實驗顯示，Jab1敲除后增強(qiáng)了曲妥珠單抗誘導(dǎo)的凋亡作用。本研究結(jié)果提示，在乳腺癌中，Jab1過表達(dá)可能誘導(dǎo)其發(fā)生對曲妥珠單抗治療耐藥，雖然這一現(xiàn)象的具體機(jī)制需要進(jìn)一步的研究，但是本研究對臨床上逆轉(zhuǎn)乳腺癌治療中的曲妥珠單藥耐藥提供了新的思路。

圖6 Jab1敲除后對C6細(xì)胞凋亡的影響

Fig.6ApoptosisrateofC6cellsafterJab1knockdown