崔苗苗，佟彥林，李 寧，蘇玉銘，魏 澍，任玉峰，李欣南，李 冰，周鐵忠?

（1.錦州醫(yī)科大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，遼寧 錦州 121001；2.遼寧省動(dòng)物衛(wèi)生監(jiān)測(cè)預(yù)警中心，遼寧 沈陽(yáng) 110001；3.遼寧省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 沈陽(yáng) 110161；4.遼寧省大連市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，遼寧 大連 116037；5.遼寧省獸藥飼料畜產(chǎn)品質(zhì)量安全檢測(cè)中心，遼寧 沈陽(yáng) 110015）

沙門氏菌是引起人類和動(dòng)物腸炎的主要致病菌之一，根據(jù)O抗原和H抗原的不同，可將其大約分為2 637個(gè)血清型[1]，沙門氏菌的各個(gè)血清型在自然界中引起人和動(dòng)物的感染能力有所不同，只有一小部分才會(huì)引起感染[2]。雞沙門氏菌引起雞的3種類型疾病分別是雞白痢、禽傷寒和禽副傷寒，可通過(guò)種蛋垂直傳播，引起受精率和孵化率降低，雛雞生長(zhǎng)遲緩和下痢，成年雞卵巢炎而產(chǎn)蛋下降，或肝臟破裂出血而死亡，是養(yǎng)禽業(yè)最常發(fā)的傳染病之一，給養(yǎng)禽業(yè)帶來(lái)了巨大的損失。實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，由于應(yīng)用大量抗生素和化學(xué)性抗菌藥物對(duì)本病進(jìn)行預(yù)防控制，造成了嚴(yán)重的細(xì)菌耐藥性和禽蛋肉產(chǎn)品中的藥物殘留，導(dǎo)致了本病的防治困難和食品安全問(wèn)題[3]。為了預(yù)防新耐藥菌株的產(chǎn)生，更有效地治療雞腸炎沙門氏菌病，本試驗(yàn)對(duì)遼寧某規(guī)模雞場(chǎng)進(jìn)行了雞沙門氏菌鑒定分型和敏感藥物篩選，為雞沙門氏菌病的診斷和防治提供了參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 于2017年9月，遼寧省錦州市某規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)，飼養(yǎng)的6 000只AA肉雞，有一棟約2 000只12日齡左右肉雞雛疑似雞沙門氏菌感染發(fā)病，選擇具有典型雞沙門氏菌臨床癥狀的病死雞100只，無(wú)菌取其肝臟、脾臟和腸道，冷藏送到實(shí)驗(yàn)室用于分離細(xì)菌。

1.1.2 試驗(yàn)動(dòng)物 選擇某雞白痢凈化種雞場(chǎng)孵化的AA雄性肉雛雞，5日齡12只；經(jīng)過(guò)雞白痢抗體檢測(cè)為陰性，經(jīng)過(guò)支原體、ND、AI、雞球蟲病等其他病原檢測(cè)也均為陰性，作為分離菌株致病性試驗(yàn)的試驗(yàn)動(dòng)物。

1.1.3 試驗(yàn)試劑 營(yíng)養(yǎng)瓊脂、SS培養(yǎng)基購(gòu)于青島海博生物技術(shù)有限公司，Gill green核酸電泳染料、dNTP Mix、DL 2000購(gòu)于北京百泰克有限公司；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；API NaCl 0.85%培養(yǎng)基和ID32E鑒定條均購(gòu)自BIOMERIEUX公司；引物由南京思普金生物科技公司設(shè)計(jì)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)和形態(tài)觀察 無(wú)菌條件下，將100份病料劃線于SS鑒別培養(yǎng)基，37℃，培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落，革蘭氏染色鏡檢，觀察細(xì)菌形態(tài)、顏色，反復(fù)此過(guò)程直至獲得純培養(yǎng)。

1.2.2 生化鑒定 將上述獲得的單菌落，在營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板上劃線36±1℃培養(yǎng)24 h。將待檢細(xì)菌單個(gè)菌落，懸浮于3 mL懸浮培養(yǎng)基，制備0.5麥?zhǔn)蠞舛鹊木鷳乙?，使用自?dòng)加樣器將菌懸液滴入試紙條反應(yīng)杯中，每個(gè)反應(yīng)杯中滴入55 μL，菌液和試劑滴加完畢后，37℃培養(yǎng)24 h，用細(xì)菌鑒定儀判讀。結(jié)果參考臨床微生物學(xué)診斷與圖譜[4]

1.2.3 基因鑒定分型

1.2.3.1 特異性引物的設(shè)計(jì) 鑒定雞腸炎沙門氏菌的特異性引物設(shè)計(jì)參照SH Park等[5]根據(jù)SefA gene，設(shè)計(jì)S.Enteritidis引物序列為：

STEF：5’-AACAACGGCTCCGGTAATGAGATTG-3’

STER：5’-ATGACAAACTCTTGATTCTGAAGATCG-3’

1.2.3.2 基因組DNA 將分離純化后的細(xì)菌，挑取單個(gè)菌落接種于的TSB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min震蕩4～5 h，肉眼觀察待菌液渾濁時(shí)，無(wú)菌挑取菌液進(jìn)行涂片、染色、鏡檢，證實(shí)為純培養(yǎng)物，然后將純菌液按照《細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒》（Solarbio）說(shuō)明和步驟方法，提取細(xì)菌的基因組。

1.2.3.3 PCR擴(kuò)增 以提取的基因組DNA為模板與合成的特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為30 μL：菌液 DNA 模板 3 μL、2×Tap Master Mix 15 μL、上、下游引物各 1 μL、ddH2O 10 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性2 min；94℃變性30 s，60℃退火20 s，72℃延伸20 s，共30個(gè)循環(huán)；72℃最后延伸10 min。

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的條帶進(jìn)行膠回收并送至生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果在Genbank中進(jìn)行序列比對(duì)。

1.2.4 致病性試驗(yàn) 選取5日齡雄性肉雞12只，隨機(jī)平均分為2組，對(duì)照組灌胃滅菌PBS溶液1 mL/只和試驗(yàn)組灌胃3.2×108CFU/mL重懸菌液1 mL/只，灌胃后隔離飼喂，以防交叉感染，每隔4 h觀察1次，連續(xù)觀察72 h，并記錄試驗(yàn)動(dòng)物的發(fā)病以及死亡情況。將死亡的試驗(yàn)雞剖檢，無(wú)菌采取肝臟、脾臟等病料，接種SS培養(yǎng)基，培養(yǎng)18～24 h后，使用革蘭氏染色，油鏡下觀察，從發(fā)病和死亡的試驗(yàn)雞體內(nèi)分離回收細(xì)菌。

1.2.5 藥敏試驗(yàn) 將分離已鑒定的菌株進(jìn)行14種抗菌藥物的藥敏檢驗(yàn)，用凍干型細(xì)菌定量藥敏檢測(cè)盒進(jìn)行抗菌藥物的敏感性檢測(cè)，參照美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）（2012）判定標(biāo)準(zhǔn)[6]，并對(duì)所檢測(cè)樣品進(jìn)行結(jié)果判定和分析[7-8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果100份病料接種的SS培養(yǎng)基，有73個(gè)SS培養(yǎng)基上可看到呈露珠樣的細(xì)小、無(wú)色透明或中心略帶黑色光澤、圓整、濕潤(rùn)并光滑，菌落的直徑大約有2～3 mm。使用革蘭氏染色法染色后鏡檢結(jié)果為：革蘭氏陰性、短桿菌、粉紅色、兩端稍圓，符合沙門氏菌的菌落及鏡檢特征。

圖1 雞沙門氏菌的生長(zhǎng)狀態(tài)與形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig.1 Growth state and morphological structure of Salmonella

2.2 細(xì)菌生化試驗(yàn)結(jié)果經(jīng)生化試驗(yàn)得到結(jié)果見表1。將此生化結(jié)果通過(guò)與臨床微生物學(xué)診斷與圖譜[4]比對(duì)發(fā)現(xiàn)符合沙門氏菌生化特征。

2.3 PCR鑒定結(jié)果PCR產(chǎn)物擴(kuò)增電泳后，在約310 bp處出現(xiàn)目的片段，與腸炎沙門氏菌基因大小一致；陰性對(duì)照無(wú)條帶出現(xiàn)。

圖2PCR結(jié)果Fig.2 PCR results

表1 分離菌的生化結(jié)果Table 1 Biochemical results of isolates

2.4 致病性試驗(yàn)結(jié)果接種分離菌的試驗(yàn)雞于感染后12 h，羽毛污穢、精神沉郁、食欲下降、喜臥不愿意走動(dòng)；感染后24 h，試驗(yàn)雞拉白色或淡黃色稀糞，嚴(yán)重者肛門被糞便糊死；感染后36 h，試驗(yàn)雞全部死亡，死亡率達(dá)到100%。死亡后，剖檢可見肝臟土黃色，有淤血斑點(diǎn)，脾臟腫大。在SS培養(yǎng)基上形成露珠樣無(wú)色透明、較小的菌落；鏡下觀察為陰性小桿菌，兩端稍圓，粉紅色；符合沙門氏菌生長(zhǎng)情況和形態(tài)要求。通過(guò)以上各項(xiàng)檢測(cè)結(jié)果，證明所分離的細(xì)菌為雞源沙門氏菌。

2.5 藥敏試驗(yàn)結(jié)果將分離已獲得的73株細(xì)菌進(jìn)行14種抗菌藥物的藥敏檢驗(yàn)，結(jié)果顯示，該分離菌對(duì)氨芐西林、磺胺異噁唑等耐藥性較強(qiáng)，而對(duì)頭孢噻呋、恩諾沙星等藥物的耐藥性較弱，具體如表2所示。

表2 腸炎沙門氏菌的藥敏試驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of drug susceptibility test of S.Enteritidis

3 討論

3.1 關(guān)于沙門氏菌血清分型據(jù)報(bào)道雞源沙門氏菌血清型有腸炎、鼠傷寒、嬰兒、印第安納、雞白痢、肯塔基、德爾卑、湯卜遜、鴨、火雞、明斯特、胥伐成格隆等，雖然血清型種類繁多、菌株復(fù)雜，分布具有很強(qiáng)的區(qū)域特點(diǎn)，但以腸炎沙門氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、印第安納沙門氏菌和德爾卑沙門氏菌等為主，優(yōu)勢(shì)血清型為腸炎、嬰兒、鼠傷寒、印第安納和雞白痢。遼寧省常發(fā)腸炎沙門氏菌、杜伊斯堡沙門氏菌、鵝沙門氏菌，本次鑒定腸炎沙門氏菌血清型在我國(guó)北京、上海、河北、山東地區(qū)均有報(bào)道[9-11]，沙門氏菌的血清型分布也具有明顯的地域性特點(diǎn)，腸炎沙門氏菌在北美地區(qū)的美國(guó)、加拿大，在歐洲的丹麥、荷蘭也有報(bào)道[12]。沙門氏菌血清型鑒定方法有傳統(tǒng)玻片凝集法、Luminex-xMAP法、免疫分析檢測(cè)技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增、基因芯片技術(shù)（gene chip）、沙門氏菌的新型檢測(cè)技術(shù)（如生物傳感器檢測(cè)技術(shù)、納米技術(shù)等）。傳統(tǒng)的血清學(xué)鑒定方法操作簡(jiǎn)便，但血清價(jià)格昂貴，鑒定過(guò)程步驟多，耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，要求試驗(yàn)人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)，即便如此，操作人員的主觀判斷仍有可能造成誤差。鑒于沙門氏菌血清型在流行病學(xué)研究中的重要性和傳統(tǒng)血清型鑒定方法的不足，研究人員開展了多種方法的研究以彌補(bǔ)傳統(tǒng)血清鑒定方法的不足。本研究是應(yīng)用的是基于沙門氏菌fli C特異性基因建立的PCR法對(duì)沙門氏菌血清型進(jìn)行鑒定分型，與其他研究者建立的方法相比，不僅具有反應(yīng)快速、高效、靈敏和成本低的優(yōu)點(diǎn)，且理論上可以鑒定589種沙門氏菌血清型；只要有普通PCR儀的實(shí)驗(yàn)室就可以開展沙門氏菌血清型的分型鑒定，能滿足一般實(shí)驗(yàn)室的要求。

3.2 關(guān)于沙門氏菌的致病機(jī)制和致病性研究表明沙門氏菌的致病機(jī)制取決于其本身的毒力和宿主的結(jié)構(gòu)，菌株的毒力由毒力因子決定，很多沙門氏菌的毒力因子最近才確定，如毒力島的毒力因子，由于毒力質(zhì)粒、毒素、菌毛、鞭毛早已發(fā)現(xiàn)及研究了幾十年，所以被稱為傳統(tǒng)（典型）毒力因子。到目前為止只發(fā)現(xiàn)8種血清型含有毒力質(zhì)粒。沙門氏菌既能產(chǎn)生內(nèi)毒素也能產(chǎn)生外毒素，內(nèi)毒素是沙門氏菌細(xì)胞壁的脂多糖成分，可以導(dǎo)致體內(nèi)和體外多樣化反應(yīng)。外毒素分為2種類型，包括細(xì)胞毒素（神經(jīng)毒素）和腸毒素，目前關(guān)于沙門氏菌外毒素的作用方式了解非常有限。沙門氏菌入侵的最佳起始部位是濾泡上皮細(xì)胞，其次是在腸道上的派伊爾氏結(jié)上細(xì)胞，其位于腸道黏膜表面，所以其主要侵襲部位在腸道。關(guān)于沙門氏菌的致病性研究一直選擇健康SPF級(jí)小白鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物[13-14]，而本次試驗(yàn)首次選擇雛雞做為靶動(dòng)物進(jìn)行沙門氏菌的致病性研究，更能科學(xué)直接地驗(yàn)證其致病性。張珍（2017）[15]研究表明雞源沙門氏菌對(duì)小鼠有較強(qiáng)的致病性，致死率達(dá)到60%～80%；本試驗(yàn)選擇某雞白痢凈化種雞場(chǎng)孵化的，經(jīng)過(guò)雞白痢抗體檢測(cè)為陰性，經(jīng)過(guò)支原體、ND、AI、雞球蟲病等其他病原檢測(cè)也均為陰性的雄性雛雞，作為分離菌株致病性試驗(yàn)動(dòng)物，攻菌后36 h致死率達(dá)到100%，證明雞腸炎沙門氏菌遼寧流行菌株具有很強(qiáng)的致病性。

3.3 關(guān)于沙門氏菌的耐藥性現(xiàn)狀在遼寧錦州地區(qū)分離得到的腸炎沙門氏菌的藥敏結(jié)果與其他文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果稍有不同，可能是由于血清型不同、細(xì)菌本身突變以及地區(qū)用藥的習(xí)性有關(guān)。劉新靜[16]2012～2014年在對(duì)從河北省幾個(gè)地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)分離出的142株雞沙門氏菌對(duì)15種藥物產(chǎn)生各種程度的耐藥，對(duì)磺胺異噁唑耐藥率為81.69%，四環(huán)素則為40.41%。王德寧[17]將來(lái)自哈爾濱疑似沙門氏菌感染的雞場(chǎng)分離到的44株菌株，進(jìn)行了耐藥的分析試驗(yàn)，結(jié)果顯示，氨芐西林對(duì)沙門氏菌具有最高的耐藥率，達(dá)到95.5%。韋婷[18]于2012～2013年期間檢測(cè)了四川地區(qū)市場(chǎng)雞肉中沙門氏菌的含量，結(jié)果其平均檢出率為28.0%；并對(duì)其做了耐藥性分析，數(shù)據(jù)顯示對(duì)3種以上抗生素耐藥的菌株達(dá)72.13%，最耐藥的抗生素為萘啶酸。關(guān)茹飛等[19]對(duì)烏魯木齊周邊雞場(chǎng)的沙門氏菌進(jìn)行耐藥性檢測(cè)，檢測(cè)到的80株雞源沙門氏菌對(duì)環(huán)丙沙星和恩諾沙星的耐藥最為嚴(yán)峻。周榮云等[20]在揚(yáng)州地區(qū)采集病料分離得到的21株鼠傷寒沙門氏菌，藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明對(duì)鏈霉素耐藥占42.86%，對(duì)復(fù)方新諾明占47.62%，10株分離株出現(xiàn)了多重耐藥現(xiàn)象。建議臨床上合理選擇并應(yīng)用抗微生物類藥物，采取聯(lián)合用藥或者輪換用藥；降低細(xì)菌耐藥性的產(chǎn)生與發(fā)展，迫切需要開發(fā)抗感染中藥提取物以避免耐藥性產(chǎn)生和提高療效。沙門氏菌產(chǎn)生耐藥性是因?yàn)榧?xì)菌本身能改變抗微生物藥的作用靶位，阻礙了抗微生物藥被識(shí)別[21]，動(dòng)物機(jī)體對(duì)抗微生物藥的轉(zhuǎn)化利用率降低，治療效果不顯著，有些抗微生物藥甚至以原液直接通過(guò)糞便、尿液、唾液等方式排出體外，進(jìn)而破壞了生態(tài)系統(tǒng)的平衡[22-25]，世界衛(wèi)生組織將沙門氏菌列入嚴(yán)重危害的食品傳播性病原體，迫在眉睫解決這個(gè)問(wèn)題成為重中之重[26]。