許國洋，付利芝，龍小飛 ，陳朝洪，李鵬飛，張素輝 ?

（1.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 402460；2.重慶市武隆區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 408500；3.貴州大學(xué)，貴州 貴陽 550000）

偽結(jié)核棒狀桿菌（Corynebacterium pseudotuberculosis）是引起干酪性淋巴結(jié)炎的主要病原菌，能使綿羊、山羊、駱駝等多種動物發(fā)病的人獸共患病[1]。近年來，我國許多省份或地區(qū)的山羊均有不同程度感染此病，部分地區(qū)甚至發(fā)病率超過80%，對山羊健康養(yǎng)殖造成嚴重危害[2]。因此，開展偽結(jié)核棒狀桿菌的檢測及防控技術(shù)研究十分必要。疊氮嗅化丙錠（PMA）是一種DNA染料，能夠進入破損細胞膜，與DNA選擇性共價交聯(lián)結(jié)合，在可見光（吸收峰460 nm）的照射下，PMA可修飾DNA分子，阻礙交聯(lián)DNA的PCR擴增，而PMA不會與活菌DNA結(jié)合，不會影響活菌的PCR鑒定，目前，PMA已被廣泛應(yīng)用于多種活菌的檢測中[3]。高達芳等[4]將PMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了馬鈴薯青枯病病菌的活菌檢測方法，并成功對臨床樣品中的活菌進行了檢測。張晶等[5]將PMA與RTi-PCR技術(shù)相結(jié)合，成功建立了一種快速準(zhǔn)確的創(chuàng)傷弧菌檢測方法。由于偽結(jié)核棒狀桿菌對培養(yǎng)條件要求較高，通過傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)方法來鑒定樣品中的偽結(jié)核棒狀菌，常出現(xiàn)漏檢[6-7]。而直接對樣品進行分子鑒定時，又可能受到死菌干擾，造成檢測結(jié)果的誤判，可能造成藥物的浪費。此外，針對偽結(jié)核棒狀桿菌活菌檢測的方法相對較少?；诖?，本研究將PMA與PCR技術(shù)相結(jié)合，建立了偽結(jié)核棒狀桿菌的活菌PMA-PCR檢測方法，為偽結(jié)核棒狀桿菌的死活鑒定提供理論依據(jù)，也給該病的防控奠定了一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株偽結(jié)核棒狀桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌由重慶市畜牧科學(xué)院獸醫(yī)獸藥研究所保存。

1.2 試劑PMA試劑購自美國Biotium公司；細菌基因組DNA提取試劑盒購自TIANGEN（北京）有限公司；胎牛血清（FBS）購自Gibco有限公司；PCR Master Mix（2×）、DNA Marker DL 2000等試劑購自寶生物工程（大連）有限公司；500W鹵素?zé)簦ㄐ吞枺篞VF135，購自Philips公司）。

1.3 引物設(shè)計及PCR擴增根據(jù)Genbank中偽結(jié)核棒狀桿菌的磷脂酶D基因序列設(shè)計特異性引物F/R，序列信息為：F：5’-GTGAGAAGAACCCCGGTATAAG-3’；R：5’-TACCGCACTTATTCTG ACA C TG-3’，產(chǎn)物大小為291 bp。引物由生工生物公司（上海）有限公司合成。PCR反應(yīng)體系25 μL：12.5 μL 2 ×Taq Mix，上、下游引物（10 μm）各0.5 μL，DNA模板2 μL，滅菌ddH2O補至25 μL。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，30個循環(huán)；72℃終延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，并送生工生物公司（上海）有限公司測序。

1.4 最佳滅活溫度的篩選取4 mL偽結(jié)核棒狀桿菌液（1×108cfu/mL）分別裝于4支1.5 mL離心管中，置于60、70、80、90℃水浴中滅活10 min后冷卻至室溫，吸取0.2 mL菌液涂布于胎牛血清培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)36～48 h，觀察是否有菌落長出并計數(shù)。

1.5 PMA-PCR最佳曝光時間優(yōu)化取4 mL滅活偽結(jié)核棒狀桿菌液（1×108cfu/mL）分別裝于4支1.5 mL離心管中，分別加入終濃度為20 μm的PMA，振蕩混勻，置于黑暗處孵育10 min，在距離500 W氯素?zé)?0 cm處，分別曝光5、10、15、20 min，每隔2～3 min，進行震蕩混勻。并設(shè)不加PMA的滅活菌液作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照，光照交聯(lián)后，提取各組處理后的菌液基因組進行PCR擴增，確定最適曝光時間。

1.6 PMA最適濃度優(yōu)化取6 mL熱滅活偽結(jié)核棒狀桿菌懸液（1×108cfu/mL）分別置于6支1.5 mL離心管中，分別加入終濃度為1、5、10、15、20、25 μmol/L的PMA溶液，振蕩混勻，避光孵育10 min后，以最佳曝光時間進行光照交聯(lián)，提取各組處理后的菌液基因組進行PCR擴增，確定能夠完全抑制熱滅活偽結(jié)核棒狀桿菌PCR擴增的最小PMA濃度。同時，以熱滅活后不加PMA作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照。另取6 mL偽結(jié)核棒狀桿菌活菌懸液（1×108cfu/mL）置于6支1.5 mL離心管中，分別加入終濃度為 15、20、25、30、40、45、50 μmol/L的PMA溶液，參照上述方法，確定不抑制偽結(jié)核棒狀桿菌活菌PCR擴增的最大PMA濃度。同時，以活細菌不加PMA作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照。

1.7 PMA-PCR 特異性分析分別取偽結(jié)核棒狀桿菌、鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌和沙門氏菌懸液1 mL，提取基因組，進行PMA-PCR擴增，分析該方法的特異性。

1.8 PMA 對不同比例活菌/死菌的樣品檢測效果按照表1制備不同濃度的活菌與死菌懸液，各取500 μL，充分混勻后，提取基因組，以最適反應(yīng)條件進行PMA-PCR擴增。同時，以不加PMA作為陽性對照，ddH2O作為陰性對照。

表1 死和活偽結(jié)核棒狀桿菌液混合比例Table 1 Mixed proportion of dead and live Corynebacterium pseudotuberculosis

2 結(jié)果與分析

2.1 菌液滅活時間通過對不同溫度滅活處理的偽結(jié)核棒狀桿菌的活菌計數(shù)，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溫度≥70℃時，所有菌體均被殺滅，滅活效果較好。

表2 滅活效果統(tǒng)計結(jié)果Table 2 Statistical results of inactivation effects

2.2 PMA最佳曝光時間通過對最適曝光時間的篩選，發(fā)現(xiàn)隨著曝光時間的增加，DNA條帶亮度逐漸減弱，當(dāng)曝光時間為15 min時，PMA-PCR擴增產(chǎn)物完全消失，說明最佳曝光時間為15 min，可以完全抑制死菌的PCR擴增，見圖1。

圖1 PMA最佳曝光時間Fig.1 PMA optimal exposure time

2.3 PMA的最適使用濃度篩選由圖2可知，隨著PMA濃度增加，PMA與滅活偽結(jié)核棒狀桿菌DNA結(jié)合越多，DNA的亮度也隨之減弱。當(dāng)PMA濃度大于20 μmol/L時，目的基因片段消失，表明熱滅活偽結(jié)核棒狀桿菌的PCR擴增被完全抑制。因此，完全熱滅活抑制偽結(jié)核棒狀桿菌PCR擴增的最小PMA濃度為20 μmol/L。由圖3可知，PMA濃度為15～30 μmol/L時，DNA亮度一致，但當(dāng)PMA濃度達到35 μmol/L時，DNA亮度開始減弱，說明PMA對活菌DNA擴增開始產(chǎn)生一定的抑制作用。因此，不抑制活偽結(jié)核棒狀桿菌PCR擴增的PMA最大濃度為30 μmol/L。故確定PMA最適濃度為20 μmol/L。

2.4 PMA-PCR的特異性通過對PMA-PCR檢測方法的特異性分析，發(fā)現(xiàn)所有參考菌株中，僅偽結(jié)核棒狀桿菌的基因組擴增出了單一目的條帶，其他菌株無條帶，與預(yù)期結(jié)果一致，見圖4。

圖2 完全抑制熱滅活偽結(jié)核棒狀桿菌PCR擴增的最小PMA濃度Fig.2 The minimum PMA concentration for PCR amplification of thermoinactivated pseudomonas tuberculosis

圖3 不抑制偽結(jié)核棒狀桿菌活菌PCR擴增的最大PMA濃度Fig.3 Does not inhibit the maximum PMA concentration of PCR amplification of live bacteria of Corynebacterium pseudotuberculosis

圖4 特異性檢測Fig.4 Specific detection

2.5 PMA 對不同比例活菌/死菌的樣品檢測效果在PMA-PCR最適反應(yīng)條件下，當(dāng)含有固定數(shù)量的死偽結(jié)核棒狀桿菌時，DNA亮度隨活偽結(jié)核棒狀桿菌數(shù)量減少而逐漸減弱，當(dāng)活菌濃度為1×102cfu/mL時，DNA的亮度消失（見圖5）；當(dāng)含有固定數(shù)量的活偽結(jié)核棒狀桿菌時，DNA亮度一致，不隨死菌數(shù)量的變化而變化，結(jié)果如圖6。因此，在含有不同比例的死、活偽結(jié)核棒狀桿菌的懸液中，20 μmol/L濃度的PMA能夠完全抑制死偽結(jié)核棒狀桿菌的PCR擴增，且不對活菌產(chǎn)生抑制作用，檢測活菌最低濃度達到1×104cfu/mL。

圖5 固定數(shù)量死菌與變化數(shù)量活菌混合液PMA-PCR檢測結(jié)果Fig.5 PMA-PCR results of a fixed number of dead bacteria and varying amounts of live bacteria mixture

圖6 固定數(shù)量活菌與變化數(shù)量死菌混合液PMA-PCR檢測結(jié)果Fig.6 PMA-PCR results of a fixed amount of live bacteria and varying amounts of dead bacteria mixture

3 討論

偽結(jié)核棒狀桿菌是一種典型的接觸傳播性疾病，具有傳播快、發(fā)病率高的特點，可引起淺表淋巴結(jié)及肝臟、肺臟等多個臟器的炎癥反應(yīng)，出現(xiàn)大小不等的結(jié)節(jié)，嚴重時，引發(fā)器官的衰竭，造成死亡[8]。該菌感染動物后，會影響動物消化道功能，導(dǎo)致機體出現(xiàn)營養(yǎng)不良、生產(chǎn)性能下降等癥狀，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大危害，近年來已引起學(xué)者廣泛關(guān)注[9]。目前，針對該病的治療藥物及疫苗產(chǎn)品相對較少，對病灶部位消毒處理是該病的主要治療手段。此外，偽結(jié)核棒狀桿菌對生長條件要求較高，普通微生物的培養(yǎng)條件難以達到該菌分離純化的目的[10]。在疫病診斷方面，直接對樣品中偽結(jié)核棒狀桿菌進行分子鑒定時，可能受死菌基因組影響，造成結(jié)果誤判，無法實現(xiàn)合理用藥。而基于PCR的分子生物的檢測的方法應(yīng)用較多，但無法判斷病原菌死活狀態(tài)，難以達到準(zhǔn)確檢測的目的。因此，對偽結(jié)核棒狀桿菌活菌的快速、準(zhǔn)確的檢測對疫病防控十分關(guān)鍵。

PMA是一種具有高度親和力的光敏DNA染料能選擇性地與死菌DNA分子共價交聯(lián)，阻斷DNA分子的PCR擴增。而較高濃度的PMA對活菌的細胞膜會產(chǎn)生滲透作用，因此，PMA的使用濃度需要既能完全抑制死菌的PCR擴增，又不會對活菌的PCR擴增產(chǎn)生抑制作用。本研究結(jié)果表明，PMA濃度為20 μmol/L時，能夠完全抑制熱滅活偽結(jié)核棒狀桿菌的PCR擴增，當(dāng)PMA濃度超過30 μmol/L時，對活偽結(jié)核棒狀桿菌的PCR擴增產(chǎn)生一定的抑制作用，在最適反應(yīng)條件下，所建立的PMA-PCR檢測方法具有較高的特異性，且在死、活偽結(jié)核棒狀桿菌混合液中對活菌的最低檢測限度為1×104cfu/mL。

4 結(jié)論

本研究建立的PMA-PCR檢測方法可快速、有效地針對山羊偽結(jié)核棒狀桿菌進行病原細死/活檢測，在指導(dǎo)合理用藥及病原菌分離培養(yǎng)與鑒定方面具有重要作用，也為該病防控提供了理論依據(jù)。