王樹艷，沈前程

（1.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530007；2.廣西金陵農(nóng)牧集團(tuán)有限公司，廣西 南寧 530049）

高質(zhì)量的DNA在開展基因組分子生物學(xué)試驗(yàn)和動(dòng)物分子育種檢測(cè)中起基礎(chǔ)性的作用[1]，通過提取雞DNA，通過PCR方法鑒定雞矮腳基因[2]、隱性白基因[3]。雞血樣中含有豐富的DNA。提取高質(zhì)量雞血樣DNA提取方法多樣[4]，各有優(yōu)缺點(diǎn)?，F(xiàn)行的雞血樣DNA提取存在過程復(fù)雜，使用有機(jī)試劑或價(jià)格昂貴等缺點(diǎn)[5-7]。為更有效地提取雞血樣DNA，本試驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，經(jīng)過改進(jìn)建立了一種簡便、快捷的雞抗凝血DNA提取方法，它優(yōu)于現(xiàn)行的血液DNA提取試劑盒。該法提取的DNA，質(zhì)量穩(wěn)定，純度高。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑分光光度儀（Nanno-100微量）；PCR儀（SEDI G Thermo Cycler）；凝膠成像儀（美國威泰克）；2xTaq PCR Master Mix（天根生化科技（北京）有限公司），TIANamp Blood DNA Kit試劑盒；EDTANa2、無水乙醇、NaCl等其他試劑為化學(xué)分析純。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞抗凝血采集 翅下靜脈采集12只 3%EDTANa2（抗凝劑:血液=1:9）抗凝的青腳麻羽公雞血樣（廣西金陵種雞場(chǎng)），用以下方法分別提取DNA。

1.2.2 試劑盒提取DNA 按血樣DNA提取試劑盒說明書進(jìn)行，取20 μL抗凝血，加入20 μL Proteinase K溶液，混勻；加200 μL緩沖液GB，充分顛倒混勻，56℃放置10 min，其間顛倒混勻數(shù)次，溶液應(yīng)變清亮；加200 μL無水乙醇，充分顛倒混勻，此時(shí)可能會(huì)出現(xiàn)絮狀沉淀；將上一步所得溶液和絮狀沉淀都加入一個(gè)吸附柱CB3中，12 000 r/min，離心30 s，倒掉收集管中的廢液， 將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入500 μL已加入無水乙醇緩沖液GD，12 000 r/min，離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；向吸附柱CB3中加入600 μL已加入無水乙醇漂洗液PW，12 000 r/min，離心30 s，倒掉收集管中的廢液，將吸附柱CB3放入收集管中；重復(fù)操作上步驟；12 000 r/min，離心2 min，倒掉廢液。將吸附柱CB3置于室溫放置數(shù)分鐘，以徹底晾干吸附材料中殘余的漂洗液；將吸附柱CB3轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中，向吸附膜中間位置懸空滴加50 μL洗脫緩沖液TB，室溫放置2～5 min，12 000 r/min，離心2 min，將溶液收集到離心管中（約1 h）。

1.2.3 本法提取DNA 取雞抗凝血100 μL，加入250 μL 裂 解 液（50 mm EDTA-Na2、2%SDS、0.19 mol NaCl），放入56～60℃水浴鍋30 min；加入600 μL 3 mol NaCl，顛倒3～5次混勻，入90℃水浴鍋30 min；4 000 r/min，10 min，取上清200 μL（含DNA）轉(zhuǎn)移到另一新的1.5 mL EP管中，加入95%乙醇400 μL，顛倒3次；4 000 r/min，2 min，小心棄上清；加入600 μL 70%乙醇、顛倒3～5次，4 000 r/min，2 min；小心棄棄上清，收集沉淀室溫吹干，加入200 μL TB溶解。

1.2.4 DNA樣品純度和濃度測(cè)量 Nanno～100微量分光光度儀測(cè)定,讀取260 nm和280 nm的吸光度值A(chǔ)，計(jì)算DNA的含量，單位ng/μL，DNA純度以A260/A280表示，純度（A260/A280）應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)的1.7～2.0之間。

1.2.5 DNA樣品完整性測(cè)量 提取DNA后稀釋到48 ng/μL，取6 μL采用1%瓊脂糖凝膠電泳（含GoldView核酸染色劑，6 μL/100 mL），電壓110 V，30 min。在凝膠成像系統(tǒng)下觀察，拍照記錄。

1.2.6 結(jié)果分析 應(yīng)用SPSS軟件對(duì)以上數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。結(jié)果用mean±S表示，統(tǒng)計(jì)顯著性以P＜0.05判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法耗時(shí)和費(fèi)用該試驗(yàn)比較兩種DNA提取的方法（見表1）。在提取DNA所用時(shí)間上都約用時(shí)1 h，無顯著差異。試劑盒提取過程約9個(gè)步驟的間斷操作，費(fèi)用5～6元/樣；本試驗(yàn)方法提取DNA需要6個(gè)步驟的間斷操作，費(fèi)用0.2～0.4元/樣，過程相對(duì)簡單，一般離心機(jī)就能滿足需求。同時(shí)，該法提取DNA過程中，利用DNA在鹽中的溶解度和溫度對(duì)蛋白的變性作用提取，未使用有機(jī)溶劑。而該試劑盒未對(duì)試劑的主要成分進(jìn)行說明，不能確定是否含有對(duì)環(huán)境有害的有機(jī)溶劑。

表1 兩種方法提取樣本DNA的步驟、儀器需求、所需時(shí)間、費(fèi)用Table 1 The cost,time,requirements and steps of extracted DNA by two kinds of method

2.2 DNA樣品純度和濃度用核酸蛋白定量儀測(cè)定純度和濃度，優(yōu)質(zhì)DNA的OD260/OD280值在1.7～2.0。兩種方法提取DNA測(cè)量結(jié)果如表2所示。DNA的OD260/OD280值都在1.7～2.0。濃度和純度分別進(jìn)行單因素方差分析，P值分別為0.000 01和0.028，差異顯著（P＜0.05）。

該試驗(yàn)方法提取的DNA的OD260/OD280平均值為1.82，DNA純度比試劑盒法好，差異顯著（P＜0.05）。本試驗(yàn)方法與試劑盒法提取的DNA純度和濃度上都存在優(yōu)勢(shì)。平均質(zhì)量濃度差異顯著是否和血液的需要量有關(guān)，有待進(jìn)一步的研究。

2.3 DNA樣品完整性兩種方法提取雞血液DNA分別隨機(jī)選擇4份，試劑盒分別標(biāo)識(shí)1～4。本法提取分別標(biāo)識(shí)5～8。采用1%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)下觀察DNA條帶并拍照?？梢娫摲ㄌ崛NA電泳DNA分子量大于2 000 pb，帶最為致密，無降解；與試劑盒法無差異（見圖1）。

表2 兩種方法提取樣本DNA的濃度、純度及血液需要量（n=12）Table 2 The concentration,purity and blood volume of extracted DNA by two kinds of method

圖1 兩種方法提取DNA瓊脂糖電泳圖Fig.1 DNA electrophoresis of two extraction methods

3 討論

3.1 快速、高效、環(huán)保的雞基因組DNA提取方法，對(duì)雞分子選育技術(shù)的推廣和應(yīng)用有重要意義。目前，雞血樣DNA提取方法主要是有機(jī)溶劑法，鹽溶有機(jī)溶劑分離法和一些商品試劑盒[8-9]。有機(jī)溶劑和鹽溶有機(jī)溶劑分離法在提取DNA過程中使用有毒、有害的有機(jī)溶劑，限制了該方法的推廣。試劑盒提取雞血樣DNA價(jià)格比較昂貴，主要應(yīng)用在科學(xué)研究等少量樣本。有研究者比較酚法和鹽析法后，發(fā)現(xiàn)鹽析法在羊血樣DNA提取可以減少操作時(shí)，更好地保存DNA完整性[10]。本法利用DNA在鹽中的溶解特性和蛋白質(zhì)的熱變特性提取DNA，在試驗(yàn)中利用SDS裂解作用，將細(xì)胞破碎，高鹽濃度下DNA與蛋白質(zhì)的溶解度不同，使用加熱方法，使基因組DNA與組蛋白分離，最后離心取上清液，通過乙醇沉淀，即可獲得基因組DNA。相比試劑盒法，費(fèi)用只占其4%，極大地節(jié)約了成本；簡化了提取DNA步驟，使用的設(shè)備簡單，無有機(jī)溶劑。在大量樣本提取時(shí)，費(fèi)用少、設(shè)備簡單、提取過程健康無有機(jī)溶劑污染的特點(diǎn)，使得方法具有突出的優(yōu)勢(shì)。

3.2 DNA的純度和濃度是關(guān)系到下游試驗(yàn)如PCR、酶切等的質(zhì)量。本法提取的DNA無降解，與試劑盒提取的方法相比較，差異不大。在提取的濃度和純度方面都優(yōu)于試劑盒提取的DNA，不會(huì)影響下游試驗(yàn)。有研究者研究酚-氯仿法，鹽析有機(jī)溶劑析出和試劑法，也發(fā)現(xiàn)試劑盒法在提取雞抗凝血DNA在濃度和純度上的不足[8]。不同動(dòng)物的血樣在提取DNA的方法和試劑上要求不同，這可能是試劑盒提取的雞血樣DNA在濃度和純度存在差異的原因。

3.3 提取的DNA樣品完整性，在后續(xù)的研究中起到重要的作用。該放法提取的DNA分子量大于2 000 pb，無降解，完全滿足對(duì)DNA研究的完整性要求。

3.4 在分子輔助檢測(cè)選育過程中，家畜基因組選擇改良上[9]，大批量樣本的DNA提取檢測(cè)時(shí)，DNA提取和PCR檢測(cè)成功率非常重要。有研究發(fā)現(xiàn)不同方法提取的DNA的提取成功率和下游試驗(yàn)的成功率都存在差異。研究發(fā)現(xiàn)酚-氯仿法、試劑盒法和鹽溶有機(jī)溶劑分離法等DNA提取成功率分別為92.7%、95.8%和99.1%；PCR檢測(cè)成功率分別為92.1%、95.6%和98.2%[8]。發(fā)現(xiàn)提取DNA的過程中，使用有機(jī)溶劑越多，DNA提取、PCR檢測(cè)的成功率越低。這可能和提取過程中有機(jī)溶劑在DNA中殘留有關(guān)。本法提取DNA（未使用有機(jī)溶劑），一次提取成功率為99%（462/466），一次檢測(cè)成功率99%（458/462）（數(shù)據(jù)未發(fā)表）。該法提取的DNA在純度、濃度和DNA完整性等方法都達(dá)到甚至高于試劑盒。

綜合來看，本法提取DNA是一種環(huán)保、簡潔適合雞血液基因組DNA提取的方法，適合大批量樣本的DNA提取，滿足雞的分子育種、分子輔助選育過程中對(duì)DNA的要求。