聶利波，李 旺，史敦勝，宋洋洋，王占彬

(河南科技大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，河南 洛陽(yáng) 471003)

中國(guó)是農(nóng)業(yè)大國(guó)，每年能夠生產(chǎn)數(shù)以萬(wàn)噸糧食，同時(shí)也產(chǎn)生大量農(nóng)產(chǎn)品廢棄物。其中的大部分都以焚燒的方式進(jìn)行處理，不僅造成了環(huán)境的污染，同時(shí)也浪費(fèi)了大量資源[1]。秸稈、麩皮、稻殼等產(chǎn)量較大，同時(shí)也是浪費(fèi)最嚴(yán)重的，而其中的主要成分纖維素卻可以作為飼料原料供畜牧業(yè)生產(chǎn)使用。但由于纖維素結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，這些纖維素原料難以被動(dòng)物消化吸收，同樣會(huì)造成資源的浪費(fèi)[2]。

纖維素酶能夠?qū)⒗w維素降解為可以供動(dòng)物機(jī)體消化吸收的葡萄糖，為緩解畜牧業(yè)中飼料來(lái)源緊缺的局面提供可能。纖維素酶的來(lái)源十分廣泛，在植物、細(xì)菌、真菌和動(dòng)物體內(nèi)均能分泌或生成纖維素酶[3-4]。隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，尤其是分子生物技術(shù)的逐漸成熟，科技工作者通過(guò)基因重組和篩選的方式，從自然界中獲得能夠降解纖維素的纖維素酶基因，將其整合到特定細(xì)菌的基因組中，以便達(dá)到降解纖維素的目的。由于大多數(shù)的纖維素酶都是通過(guò)微生物分泌的，進(jìn)行篩選和構(gòu)建重組菌時(shí)，選擇對(duì)動(dòng)物機(jī)體無(wú)害的益生菌作為宿主菌，不但能促進(jìn)動(dòng)物機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收，而且對(duì)目前畜牧行業(yè)存在的抗生素濫用現(xiàn)象也是一種有效的抵制。

本試驗(yàn)的研究對(duì)象是一株源自于動(dòng)物腸道的益生菌——野生型枯草芽孢桿菌(B.subtilis) LN，經(jīng)過(guò)基因重組技術(shù)改造后，篩選出能夠表達(dá)纖維素酶的重組菌B.subtilisKpg，通過(guò)研究其最適反應(yīng)溫度和最適反應(yīng)pH，以及對(duì)麩皮中纖維素和真蛋白含量的影響，為重組菌B.subtilisKpg的實(shí)際應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌 種 產(chǎn)纖維素酶的重組菌B.subtilisKpg，野生型B.subtilisLN，均由河南科技大學(xué)生物飼料和精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 LB固體培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化鈉10 g，瓊脂粉20 g，蒸餾水定容到1 L，121 ℃高溫高壓滅菌25 min。

種子培養(yǎng)基：牛肉膏0.5 g，蛋白胨1 g，氯化鈉0.5 g溶于90 mL滅菌水，待溶解完全后，定容至100 mL，121℃滅菌25 min。

固體發(fā)酵培養(yǎng)基：麩皮100 g，氯化銨2 g，氯化鈉1 g，滅菌水60～70 mL。

1.1.3 主要試劑的配制 CMCA底物溶液：羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)1 g，磷酸鹽緩沖液定容至100 mL。121 ℃滅菌25 min，4 ℃保存。

DNS染液：3，5-二硝基水楊酸6.3 g定容至500 mL，45 ℃恒溫水浴鍋中溶解，逐步加入氫氧化鈉21.0 g，不斷攪拌，至完全溶解。緩慢加入四水酒石酸鈉182 g，再依次加入苯酚5 g，無(wú)水亞硫酸鈉5 g，置于45 ℃恒溫水浴鍋中，邊攪拌邊補(bǔ)滅菌水，使添加物完全溶解，定容至1 L。將配制好的溶液轉(zhuǎn)移褐色瓶中，置于避光處7 d后使用。

不同pH濃度磷酸鹽緩沖液的配制見(jiàn)表1，配制完成后以弱酸弱堿進(jìn)行pH值的標(biāo)定后定容至1 L。

表1 不同pH濃度磷酸鹽緩沖液的配制

1.2 方法

1.2.1 粗酶液的提取 取實(shí)驗(yàn)室保存的重組菌B.subtilisKpg 20 μL均勻涂布于LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃倒置培養(yǎng)16 h。將活化好的B.subtilisKpg挑取單菌落，接種于種子培養(yǎng)基中，置于37 ℃，220 r/min恒溫?fù)u床振蕩培養(yǎng)18 h。將菌液置于4 ℃，5 000 r/min超低溫離心機(jī)中離心30 min，上清液即為粗酶液。利用同樣的方法制備野生型B.subtilisLN粗酶液。

1.2.1 不同溫度對(duì)重組菌B.subtilisKpg纖維素酶活性的影響測(cè)定 試驗(yàn)分為7個(gè)試驗(yàn)組，每組取制備好的重組菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，加入2 mL的CMCA底物溶液，混勻后分別置于不同反應(yīng)溫度(30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)的恒溫水浴鍋中，水浴30 min。待水浴結(jié)束后加入2.5 mL DNS染液混勻，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通過(guò)流水冷卻至室溫后用去離子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物為對(duì)照組，利用紫外線分光光度計(jì)在540 nm波長(zhǎng)條件下，測(cè)定OD值。各試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。每個(gè)溫度梯度試驗(yàn)組均以野生型B.subtilisLN為對(duì)照。

酶活力單位規(guī)定： 50 ℃條件下，以1 mL纖維素酶粗酶液在1 min內(nèi)水解羧甲基纖維素鈉生成1 μg葡萄糖的酶量為1個(gè)酶活力單位。

酶活力計(jì)算公式：

式中：X. 酶活力(U/mL)；W. 測(cè)得的吸光度值；N. 酶樣所稀釋的倍數(shù)；k. 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率；T. 反應(yīng)時(shí)間；M. 酶樣體積；1000. mg轉(zhuǎn)化為μg。

1.2.2 不同pH對(duì)重組菌B.subtilisKpg纖維素酶活性的影響測(cè)定 試驗(yàn)分為10個(gè)試驗(yàn)組，每個(gè)試驗(yàn)組取制備好的重組菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，分別加入2 mL不同pH(3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)配制的CMCA底物溶液，混勻后置于50 ℃恒溫水浴鍋中，水浴30 min。待水浴結(jié)束后加入2.5 mL DNS染液混勻，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通過(guò)流水冷卻至室溫后用去離子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物為對(duì)照組，測(cè)定OD540值。每組3個(gè)重復(fù)，每個(gè)溫度梯度試驗(yàn)組均以野生型B.subtilisLN為對(duì)照。

1.2.3 不同溫度、pH對(duì)重組菌B.subtilisKpg纖維素酶活性的影響測(cè)定 取制備好的重組菌B.subtilisKpg粗酶液1 mL，分別加入不同pH值(5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0)配置的CMCA底物溶液，混勻后分別置于不同反應(yīng)溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)恒溫水浴鍋中，水浴30 min。待水浴結(jié)束后加入2.5 mL DNS染液混勻，100 ℃沸水浴中煮沸10 min，迅速通過(guò)流水冷卻至室溫后用去離子水定容至25 mL。以不加酶液的相同底物為對(duì)照組，測(cè)定OD540值。各試驗(yàn)組3個(gè)重復(fù)。

1.2.4 麩皮發(fā)酵試驗(yàn) 選擇5個(gè)固體發(fā)酵培養(yǎng)基分別加入無(wú)菌種子培養(yǎng)基、重組菌B.subtilisKpg粗酶液、重組菌B.subtilisKpg菌液、野生型B.subtilisLN粗酶液和野生型B.subtilisLN菌液，添加量均為10 mL?；靹蛑糜跓?，用報(bào)紙包好，并用針頭扎孔，放置于37 ℃ 恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，靜止培養(yǎng)6 d。每隔1 d翻動(dòng)一次，并適當(dāng)補(bǔ)水。發(fā)酵完成的培養(yǎng)產(chǎn)物置于65 ℃烘箱中進(jìn)行烘干，至培養(yǎng)產(chǎn)物中水分一致。

1.2.5 發(fā)酵麩皮中纖維素和真蛋白含量的測(cè)定 發(fā)酵麩皮中纖維素和真蛋白含量的測(cè)定參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測(cè)技術(shù)》中纖維素[5]67-77和真蛋白[5]48-53的測(cè)定方法進(jìn)行。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 試驗(yàn)結(jié)果用Excel 2013軟件進(jìn)行預(yù)處理，用SPSS 19.1統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，采用Duncan氏法進(jìn)行多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同溫度對(duì)纖維素酶活性的影響

不同反應(yīng)溫度下，重組菌B.subtilisKpg的纖維素酶活性均大于野生型B.subtilisLN，但兩者的粗酶液隨溫度的變化趨勢(shì)類(lèi)似。反應(yīng)溫度為60 ℃時(shí)，酶活性最大為108.45 U/mL，與對(duì)照組相比提高了172%。超過(guò)60 ℃之后，隨著反應(yīng)溫度的升高，重組菌B.subtilisKpg纖維素酶活性逐漸降低，反應(yīng)溫度到達(dá)90 ℃時(shí)，纖維素酶活最低，但依舊能表現(xiàn)出一定的活性，為8.80 U/mL(圖1)。

2.2 不同pH對(duì)纖維素酶活性的影響

pH值為6時(shí)，重組菌B.subtilisKpg纖維素酶活性最大為97.72 U/mL，相對(duì)于野生型B.subtilisLN酶活性提高了220%。pH為3時(shí)，重組菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN的纖維素酶活性均為最低，僅為5.03 U/mL和5.65 U/mL。反應(yīng)環(huán)境為弱堿時(shí)，纖維素酶的最適pH為7.5，酶活性為78.24 U/mL，隨著pH值的增大，纖維素酶活性逐漸降低。在弱堿環(huán)境中，重組菌B.subtilisKpg纖維素酶仍能表現(xiàn)出較高的活性(圖2)。試驗(yàn)結(jié)果顯示，pH值為7時(shí)的中性環(huán)境并不是重組菌B.subtilisKpg纖維素酶的最適反應(yīng)環(huán)境。

圖1 不同溫度對(duì)重組菌與野生菌纖維素酶活力的影響

圖2 不同pH對(duì)重組菌與野生菌纖維素酶活力的影響

注：同組數(shù)據(jù)標(biāo)注不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母者為差異不顯著(P>0.05)。

Notes: In the same group, values with different lowercase letter mean significant difference (P<0.05), the same letter mean insignificant difference (P>0.05).

2.3 不同溫度、pH對(duì)纖維素酶活性的影響

通過(guò)對(duì)重組菌B.subtilisKpg粗酶液在不同反應(yīng)溫度和不同pH環(huán)境中的酶活性測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在60 ℃，pH為6.0時(shí)其酶活力最高，達(dá)到113.58±1.8 U/mL，與其他條件下相比差異顯著(P<0.05)(表2)。相同溫度條件下，當(dāng)pH為6時(shí)，重組菌B.subtilisKpg的粗酶液活力均高于其他pH條件下的酶活力；相同pH環(huán)境下，溫度為60 ℃時(shí)，重組菌B.subtilisKpg的粗酶液活力均高于其他溫度條件下的酶活力。試驗(yàn)結(jié)果與之前所測(cè)結(jié)果相符，為重組菌B.subtilisKpg的應(yīng)用提供參考。

2.4 重組菌B.subtilis Kpg對(duì)麩皮粗纖維和真蛋白含量的影響

由表3可看出，重組菌B.subtilisKpg菌液和粗酶液均能夠?qū)熎だw維素含量產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。在不添加任何菌液和粗酶液的無(wú)菌種子培養(yǎng)基中，發(fā)酵后麩皮的纖維素含量為13.1%，添加重組菌粗酶液可以使麩皮中纖維素含量降低至12.2%，添加重組菌菌液可將纖維素含量降低至11.7%，與無(wú)菌種子培養(yǎng)基試驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)；將宿主菌添加到麩皮中，粗酶液和菌液對(duì)麩皮中纖維素含量影響不明顯(P>0.05)。通過(guò)發(fā)酵麩皮試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，重組菌對(duì)纖維素的降解效果顯著(P<0.05)，證明了重組菌B.subtilisKpg在生產(chǎn)實(shí)踐中對(duì)纖維素酶降解的可靠性。

表2 不同溫度、pH對(duì)重組菌纖維素酶活力的影響

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)為不同小寫(xiě)字母表示差異顯著(P<0.05)，相同字母或無(wú)字母表示差異不顯著(P>0.05)。下同。

Notes: In the same row, values with different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05) .The same below.

表3 發(fā)酵麩皮中纖維素和真蛋白成分變化

注：同行數(shù)據(jù)后肩小寫(xiě)字母為P<0.05時(shí)差異顯著性檢測(cè)，相同字母者為差異不顯著。

Note::Values with different lowercase superscripts in the same line are significantly different (P<0.05), the same superscripts are insignificantly different.

由表3可看出，重組菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN均能將固體發(fā)酵培養(yǎng)基中的無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化為有機(jī)氮，提高真蛋白含量且差異顯著(P<0.05)。在不添加任何菌液和粗酶液的無(wú)菌種子培養(yǎng)基中，發(fā)酵后麩皮的真蛋白含量為17.4%，添加重組菌B.subtilisKpg粗酶液和野生型B.subtilisLN粗酶液的發(fā)酵麩皮，真蛋白含量提高至19.0%和19.1%，與無(wú)菌種子培養(yǎng)基試驗(yàn)組相比差異顯著(P<0.05)，但兩者之間無(wú)明顯差異(P>0.05)；添加重組菌B.subtilisKpg和野生型B.subtilisLN的菌液也能提高發(fā)酵麩皮中真蛋白含量，且差異顯著(P<0.05)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵麩皮過(guò)程中，添加粗酶液效果優(yōu)于添加相應(yīng)菌液。在一定的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，B.subtilis粗酶液可以直接發(fā)揮作用，縮短了菌液生長(zhǎng)分泌相應(yīng)酶類(lèi)的培養(yǎng)周期。

3 討 論

由于在植物中的纖維素酶含量少且難以提取，因此大多數(shù)纖維素酶的篩選都來(lái)自于微生物中。經(jīng)常被科技工作者用來(lái)生產(chǎn)纖維素酶的微生物有青霉、曲霉、芽孢桿菌、酵母菌等[6-9]。本試驗(yàn)選用的研究對(duì)象是對(duì)野生型B.subtilisLN進(jìn)行DNA改造后，能夠分泌纖維素酶的重組菌B.subtilisKpg。野生型B.subtilisLN源自于動(dòng)物腸道益生菌菌群，在生產(chǎn)使用中對(duì)動(dòng)物機(jī)體造成的不良影響可降到最低。劉鑫[10]以藏綿羊源的產(chǎn)纖維素酶B.subtilis為研究對(duì)象，使用不同的抗生素進(jìn)行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其具有良好的耐堿性、耐酸性和抗藥性。本試驗(yàn)同樣采用的是動(dòng)物源B.subtilis，為重組菌B.subtilisKpg的生產(chǎn)應(yīng)用提供理論支持。其次，B.subtilis自身對(duì)外界環(huán)境的耐受程度比較好，生存條件要求不高，便于培養(yǎng)[11]。在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在低溫、高溫和強(qiáng)酸條件下，重組菌B.subtilisKpg分泌的纖維素酶均能表達(dá)一定的活性，證明了重組菌B.subtilisKpg具有較強(qiáng)的耐受性。B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)能夠直接將表達(dá)產(chǎn)物分泌到細(xì)胞外，增加了產(chǎn)物的回收利用效率。B.subtilis憑借自身高效的信號(hào)肽和分子伴侶系統(tǒng)，可以有效地提高目的蛋白的分泌量。陳大超[12]利用B.subtilis表達(dá)系統(tǒng)構(gòu)建能夠降解有機(jī)磷的新型菌株，使其分泌的酶活性提高了0.9倍。本試驗(yàn)選用野生型B.subtilisLN作為宿主菌，目的是為了借助B.subtilis高效的表達(dá)系統(tǒng)，增加纖維素酶的表達(dá)量，為生產(chǎn)實(shí)踐提供便利。

在本研究中，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的反應(yīng)溫度梯度，探索重組菌B.subtilisKpg分泌的纖維素酶表達(dá)活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)重組菌B.subtilisKpg在30～90 ℃范圍內(nèi)均能表現(xiàn)出一定活性。張偉[13]在構(gòu)建產(chǎn)木聚糖酶B.subtilis的過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，重組菌在85 ℃的高溫環(huán)境中，酶活性最強(qiáng)，在65～95 ℃環(huán)境中，仍能保持酶活性最高時(shí)的70%，與本試驗(yàn)結(jié)果相似。B.subtilis在生長(zhǎng)繁殖過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生芽孢，對(duì)極端溫度有較好的耐受性，可以減輕表達(dá)產(chǎn)物受溫度、紫外線以及其他物質(zhì)的破壞，保持相應(yīng)的活性[14]。在飼料加工過(guò)程中，制粒時(shí)伴隨著高溫的產(chǎn)生，一般為60～80 ℃范圍內(nèi)，制粒時(shí)間大概1～2 min，因此需要微生物或者酶制劑具有一定耐熱性[15]。重組菌B.subtilisKpg能使酶活性較強(qiáng)的溫度集中在40～70 ℃之間，但在80 ℃時(shí)僅能表現(xiàn)出最高酶活性的40.1%，有待進(jìn)一步改進(jìn)提高。影響纖維素酶活性的因素除了溫度，pH的影響也很大。在動(dòng)物的消化系統(tǒng)中，各部位的pH大多維持在5～7.5之間，呈中性偏酸。重組菌B.subtilisKpg表達(dá)的纖維素酶在pH5.5～8之間均能表現(xiàn)出較高的活性，避免了纖維素酶在使用過(guò)程中失活的現(xiàn)象發(fā)生。劉暉[16]在纖維素酶的耐受性試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，其纖維素酶的最佳pH環(huán)境維持在5～7之間，與本試驗(yàn)結(jié)果相似，但酶活性最高時(shí)是在pH為5，而在本研究中，最適pH為6，這可能與纖維素酶基因的來(lái)源不同有關(guān)。纖維素酶是由多種水解酶組合在一起形成的，不同基因來(lái)源的纖維素酶基因，其組分比例也存在差異，因此對(duì)最適環(huán)境也會(huì)存在差異[17-18]。

在固體發(fā)酵試驗(yàn)中，選用麩皮為發(fā)酵原料，麩皮自身纖維素含量較高，且每年我國(guó)的麩皮產(chǎn)量很大[19]。研究重組菌B.subtilisKpg對(duì)麩皮的影響，對(duì)合理運(yùn)用麩皮具有一定的意義。通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)重組菌B.subtilisKpg可以降低麩皮中的纖維素含量，效果顯著(P<0.05)，同時(shí)還能夠顯著提高真蛋白的合成(P<0.05)。崔晨曉[20]在研究酵母菌發(fā)酵對(duì)小麥麩皮含量的影響中發(fā)現(xiàn)，酵母菌35 ℃發(fā)酵48 h條件下能使麩皮中的膳食纖維含量降低6.45%，真蛋白含量提高21.97%。在本試驗(yàn)中，重組菌B.subtilisKpg可以將麩皮纖維素降低10.7%，B.subtilis在發(fā)酵過(guò)程中利用纖維素酶可以破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，使其水解為單糖，降低纖維素含量。但在真蛋白的提高上效果不如酵母菌，僅提高9.2%。這是由于酵母菌更適合在麩皮基質(zhì)中生長(zhǎng)，在生長(zhǎng)過(guò)程中將麩皮中的無(wú)機(jī)氮轉(zhuǎn)化有機(jī)氮[21]。試驗(yàn)過(guò)程中還發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過(guò)程中，添加重組菌B.subtilisKpg菌液對(duì)麩皮中纖維素的降解最好，添加重組菌B.subtilisKpg粗酶液對(duì)麩皮中的真蛋白提高效果也是最好。因?yàn)樵诮到饫w維素的過(guò)程中，添加菌液可以增加纖維素酶的表達(dá)量。但是，纖維素酶對(duì)真蛋白的轉(zhuǎn)化卻無(wú)明顯作用，真蛋白含量的提高，只能依靠B.subtilis自身生長(zhǎng)過(guò)程中表達(dá)或分泌的某種產(chǎn)物。同時(shí)在細(xì)菌生長(zhǎng)過(guò)程中，也會(huì)消耗掉一部分的真蛋白，因此直接添加粗酶液，減少了細(xì)菌對(duì)真蛋白的利用，提升效果優(yōu)于直接添加菌液[22]。

4 結(jié) 論

重組菌B.subtilisKpg分泌纖維素酶的最適反應(yīng)溫度為60 ℃，最適pH為6.0，在兩者協(xié)同作用下纖維素酶活性為113.58 U/mL。重組菌B.subtilisKpg能夠有效減少麩皮中纖維素含量，同時(shí)明顯提高真蛋白含量。