肖 瀟,李忠玲,3,張紅艷,2,張 強(qiáng),3,吳雪利,胡云紅,2,岳淑寧,2*

(1.陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所，陜西 西安 710043；2.陜西省酶工程技術(shù)研究中心，陜西 西安 710043；3.中國科學(xué)院西北生物農(nóng)業(yè)中心，陜西 西安 710043； 4.臨潼區(qū)動(dòng)物疾病預(yù)防控制中心，陜西 西安 710600)

近年來頻繁爆發(fā)動(dòng)物疫情和食品安全問題，使得發(fā)展安全、綠色養(yǎng)殖業(yè)成為當(dāng)務(wù)之急，無污染、無殘留的飼料添加劑受到廣泛關(guān)注和應(yīng)用，例如飼用酶制劑[1]。其中，纖維素酶具有分解纖維素和半纖維素的能力[2]，促進(jìn)動(dòng)物對(duì)飼料的消化吸收，緩解腸道壓力，減輕抗?fàn)I養(yǎng)因子對(duì)動(dòng)物產(chǎn)生的不良影響[3]，已被廣泛應(yīng)用于奶牛養(yǎng)殖業(yè)中[1]。

中國2013年全國抗生素用量16.2萬噸，其中獸用抗生素占據(jù)其中的52%。而且在使用抗生素的豬養(yǎng)殖場(chǎng)中，研究人員在豬的糞便中檢測(cè)出多個(gè)獨(dú)特的多拷貝抗生素抗性基因[4]，抗生素的過度使用已成為養(yǎng)殖業(yè)的一大難題，而具有抑菌作用的益生素(也稱為益生菌)以其無污染、無殘留、安全等優(yōu)點(diǎn)成為綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的重要助力[5]。益生素可以產(chǎn)生營養(yǎng)物質(zhì)和消化酶，調(diào)節(jié)動(dòng)物腸道環(huán)境，維持腸道微生態(tài)平衡，提高動(dòng)物對(duì)飼料的吸收和利用，預(yù)防疾病的發(fā)生[6]。酪酸菌能夠與雙歧桿菌、乳酸菌、糞桿菌等腸道有益菌共生，并促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)繁殖；還能夠產(chǎn)生具有抗菌功能的有機(jī)酸，抑制病原菌的生長(zhǎng)繁殖，如沙門氏菌、致病性大腸桿菌、魏氏梭菌等[7]。地衣芽孢桿菌也具有拮抗病原菌的功能，能夠維持和調(diào)節(jié)腸道微生物菌群平衡，提高動(dòng)物的抗病能力[8]，還可為動(dòng)物提供蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、氨基酸、維生素等，調(diào)節(jié)養(yǎng)分代謝[9]。

酪酸菌和地衣芽孢桿菌分別屬于厭氧和好氧菌，具有不同的酶系。本研究利用酪酸菌和地衣芽孢桿菌代謝過程中的復(fù)合酶系和纖維素酶功能的疊加，在試驗(yàn)條件下探究其作為奶牛復(fù)合飼料添加劑的應(yīng)用效果，并為其在生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)?zāi)膛?、酶與菌種

按照同質(zhì)原則，選擇體重、泌乳月、產(chǎn)奶量基本一致的健康奶牛40頭，隨機(jī)分為4組，每組10頭；試驗(yàn)用纖維素酶購自寧夏某公司，活力為10 000 U/g，最適pH 5.5，在pH 4.5～7.5范圍內(nèi)具有較高的酶活性，在奶牛腸道中可發(fā)揮較好的酶學(xué)作用；試驗(yàn)用酪酸菌(Clostridiumbutyricum)和地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)均為陜西省生物農(nóng)業(yè)研究所保存，菌劑生產(chǎn)采用液體發(fā)酵，噴霧干燥制作。

1.2 飼喂配方

奶牛基礎(chǔ)日糧配方見表1。

表1 奶牛基礎(chǔ)日糧配方

本試驗(yàn)所使用的抗病性綠色飼料添加劑的組成主要包括地衣芽孢桿菌、酪酸菌和纖維素酶，其中酪酸菌和地衣芽孢桿菌活菌數(shù)均為20×108/g。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)3個(gè)試驗(yàn)組和1個(gè)對(duì)照組，具體分組情況見表2。所有奶牛的棚舍條件及管理方式均保持一致。本試驗(yàn)采用單因素4水平隨機(jī)分組的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，預(yù)試期10 d，正式試驗(yàn)期80 d，從2017年9月到2017年11月，在西安市臨潼區(qū)陽光牧業(yè)有限責(zé)任公司進(jìn)行。

表2 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

1.4 指標(biāo)測(cè)定及記錄

試驗(yàn)開始后觀察牛的生長(zhǎng)發(fā)育情況，記錄健康狀況。分別記錄各組奶牛每天的產(chǎn)奶量，并在第90天測(cè)定牛奶的各項(xiàng)指標(biāo)，包括乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、全脂乳固體含量、非脂乳固體含量和體細(xì)胞數(shù)目[11]。在整個(gè)飼養(yǎng)過程中記錄奶牛腸道炎的發(fā)病情況。體細(xì)胞計(jì)數(shù)采用體細(xì)胞記數(shù)儀(Somacount 150)進(jìn)行。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)牛奶產(chǎn)量、乳脂率、乳蛋白率、乳糖含量、全脂乳固體含量、非脂乳固體含量和體細(xì)胞數(shù)目進(jìn)行單因素方差分析，采用Tukey法進(jìn)行差異顯著性比較，結(jié)果用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P<0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶量的影響

抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶量的影響結(jié)果見表3。試驗(yàn)前，四組奶牛的產(chǎn)奶量無顯著差別(P>0.05)；在試驗(yàn)的不同時(shí)間段，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組的產(chǎn)奶量均顯著(P<0.05)或極顯著(P<0.01)高于對(duì)照組。其中，第30～45天分別提高了6.88%和6.79%，第45～60天提高了6.92%和7.70%，第60～75天提高了8.66%和9.89%，第75～90天提高了10.13%和10.69%。同一組奶牛在試驗(yàn)的不同時(shí)間段之間產(chǎn)奶量均無顯著差異(P>0.05)，但隨著時(shí)間的推移，試驗(yàn)2組和試驗(yàn)3組產(chǎn)奶量提高率略有增加。

表3 日均產(chǎn)奶量統(tǒng)計(jì)結(jié)果

注：同列數(shù)據(jù)比較結(jié)果用a～d表示，同行數(shù)據(jù)比較結(jié)果用m～q表示。肩標(biāo)為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。

Notes: The results of comparison in the same column are represented by a～d, while the results in the same row are represented by m～q. In the same column(row), values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01).

2.2 抗病性飼料添加劑對(duì)牛乳品質(zhì)的影響

奶牛日糧添加抗病性飼料添加劑后牛乳主要營養(yǎng)指標(biāo)見表4。由表4知，試驗(yàn)2組的乳脂率極顯著低于試驗(yàn)1組和對(duì)照組(P<0.01)；試驗(yàn)1組的乳蛋白率顯著高于試驗(yàn)2組和3組(P<0.05)；試驗(yàn)1組和試驗(yàn)3組的乳糖含量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)；添加抗病性飼料添加劑對(duì)牛乳中的全脂乳固體和非脂乳固體含量無顯著影響(P>0.05)。

表4 牛乳品質(zhì)指標(biāo)

注：同行數(shù)據(jù)肩標(biāo)為相同字母或無字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)。下同。

Notes: In the same row, values with the same or no superscripts mean insignificant difference (P>0.05), different lowercase letter superscripts mean significant difference (P<0.05), different capital letter superscripts mean extremely significant difference (P<0.01). The same below.

2.3 抗病性飼料添加劑對(duì)牛乳中體細(xì)胞數(shù)的影響

奶牛日糧中添加抗病性綠色飼料添加劑對(duì)牛乳中體細(xì)胞數(shù)的影響見表5。由表5可知，與對(duì)照組相比，試驗(yàn)2組和3組的體細(xì)胞數(shù)顯著降低(P<0.05),試驗(yàn)1組與對(duì)照組的差異不顯著(P>0.05)。試驗(yàn)1、2、3組的體細(xì)胞數(shù)減少率分別達(dá)到9.36%、28.26%、23.72%。

2.4 抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛腸炎發(fā)病率的影響

奶牛日糧中添加抗病性綠色飼料添加劑對(duì)奶牛腸炎發(fā)病率的影響見表6。由表6可知，對(duì)照組奶牛腸炎發(fā)病率為60%，試驗(yàn)1組的腸炎發(fā)病率降至20%，試驗(yàn)2組和3組的腸炎發(fā)病率均降至10%。

表5 牛乳中體細(xì)胞數(shù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果

表6 奶牛腸炎發(fā)病率統(tǒng)計(jì)

3 討 論

3.1 抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛生產(chǎn)的調(diào)節(jié)

試驗(yàn)結(jié)果顯示，添加0.10%和0.15%的抗病性飼料添加劑可顯著提高牛乳產(chǎn)量，隨時(shí)間推移牛乳產(chǎn)量的提高率逐步上升，說明本抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛產(chǎn)奶量具有持續(xù)的促進(jìn)效果，該結(jié)果與Kritas等[10]在日糧中添加地衣芽孢桿菌和枯草芽孢桿菌復(fù)合益生素時(shí)綿羊產(chǎn)奶量顯著增加的研究結(jié)果一致。周振峰[11]研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用地衣芽孢桿菌作為飼料添加劑65 d后，奶牛的產(chǎn)奶量最多可提高5.8%。本試驗(yàn)在使用添加劑60 d后奶牛的產(chǎn)奶量最多可提高9.89%，說明本研究所采用的復(fù)合型添加劑對(duì)產(chǎn)奶量的促進(jìn)效果優(yōu)于單獨(dú)使用地衣芽孢桿菌。通過在飼料中添加復(fù)合型添加劑提高了奶牛的產(chǎn)奶量，其原因可能是由于地衣芽孢桿菌為機(jī)體提供了蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶，與纖維素酶和酪酸菌共同作用提高了飼料的利用率。對(duì)乳成分分析結(jié)果表明，使用抗病性飼料添加劑對(duì)乳脂率、乳蛋白率、全脂乳固體和非脂乳固體含量均無明顯改善作用，僅對(duì)乳糖含量有顯著提升，說明雖然使用抗病性飼料添加劑能夠提升牛奶產(chǎn)量，但對(duì)乳品質(zhì)無改善作用，這與地衣芽孢桿菌添加劑對(duì)奶牛泌乳的影響結(jié)果相似[11]。

3.2 抗病性飼料添加劑對(duì)奶牛健康的影響

研究表明地衣芽孢桿菌和酪酸菌作為益生菌能夠加強(qiáng)腸道屏障、調(diào)節(jié)宿主免疫系統(tǒng)，還能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，預(yù)防腹瀉、高膽固醇血癥、炎癥性腸炎，促進(jìn)乳糖的利用和礦物質(zhì)的吸收[12]。Lan等[13]研究發(fā)現(xiàn)，和飼喂基礎(chǔ)日糧的豬相比，添加含有地衣芽孢桿菌的復(fù)合益生素添加劑能提高豬糞便中的乳酸菌數(shù)量，同時(shí)降低糞便中大腸桿菌數(shù)量、NH3和H2S排放，改善了腸道微環(huán)境，促進(jìn)腸道健康。Wang等[14]的研究也表明在日糧中添加地衣芽孢桿菌能夠顯著增加奶牛瘤胃pH、氨態(tài)氮和異戊酸的濃度，減少甲烷的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腸胃的微生物平衡，改善腸胃環(huán)境。在日糧中添加含有酪酸菌的益生素添加劑時(shí)，奶牛瘤胃的pH更加穩(wěn)定[6]，在對(duì)腸道應(yīng)激綜合癥患者進(jìn)行酪酸菌治療后，腸道菌群中的雙歧桿菌、無芽孢厭氧菌、大腸桿菌、腸球菌和乳酸菌恢復(fù)到健康水平，潛在的致病菌減少[15]。本研究所使用的復(fù)合型添加劑同時(shí)含有地衣芽孢桿菌和酪酸菌，因此，在一定程度上調(diào)節(jié)了奶牛的腸道菌群，改善了腸道健康，從而降低了腸炎發(fā)病率。而且本研究結(jié)果顯示，該飼料添加劑對(duì)奶牛隱性乳腺炎具有一定的預(yù)防效果。地衣芽孢桿菌能夠產(chǎn)生抗菌物質(zhì)，抑制潛在的乳腺炎病原菌[16]，在針對(duì)人體的研究中也發(fā)現(xiàn)，口服益生菌能夠有效的控制乳腺炎，其中的潛在機(jī)制雖然不清楚，但結(jié)果表明患乳腺炎的奶牛腸道微生物群落結(jié)構(gòu)與乳汁相似，其中乳腺炎相關(guān)病原菌數(shù)量都顯著上升，而乳酸桿菌的數(shù)量都呈下降趨勢(shì)，說明奶牛腸道微環(huán)境的平衡與乳腺健康有重要聯(lián)系[17]。目前將地衣芽孢桿菌、酪酸菌與纖維素酶混合作為復(fù)配飼料添加劑的研究還較少，本研究將這兩種微生物與纖維素酶混合，探究其對(duì)奶牛健康和生產(chǎn)的影響，為以后的生產(chǎn)實(shí)踐提供了理論基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，添加0.10%、0.15%的添加劑對(duì)減少牛乳中的體細(xì)胞數(shù)和緩解腸炎的患病率效果顯著。其中添加0.10%的添加劑能夠?qū)⑴Ｄ讨械捏w細(xì)胞數(shù)目降到20.23萬個(gè)/mL，低于添加0.15%的添加劑的體細(xì)胞數(shù)。而且在添加0.10%和0.15%的添加劑時(shí)，奶牛的腸炎患病率均為10%，牛奶的產(chǎn)量也無顯著差別，綜合考慮，添加0.10%的益生素和酶復(fù)合制劑時(shí)效果最好，且成本較低。