王 莉，謝 青，毛玉娟，楊 銳，江 華，何亞麗，申進增，伊 琳＊＊

（1.甘肅中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院 蘭州730000；2.秦安縣人民醫(yī)院 秦安741600）

原發(fā)性高血壓是全球最常見最危險的慢性疾病之一，其危害不僅是血壓升高給患者帶來的生活影響，同時會引發(fā)一系列并發(fā)癥，如高血壓所致的腦卒中，其發(fā)病率和致死率均較高；高血壓更成為心血管疾病的主要危險因素，可造成多處靶器官的損傷，甚至引發(fā)臟器功能衰竭，嚴重影響人們的健康狀況以及生活水平。據(jù)統(tǒng)計，全球高血壓患者占全球總?cè)丝诘?6%[1]，近年來有增長的趨勢，發(fā)病年齡也逐漸趨于年輕化。調(diào)查顯示，超過80%的高血壓患者以服用單純西藥降壓藥為主，雖能抑制血壓的升高，但對于各類并發(fā)癥并沒有針對性的管理和治療，療效具有較大的局限性。相比之下，中醫(yī)藥以天然中藥材為原料，具有安全降壓，副作用小，從整體水平調(diào)節(jié)人體代謝系統(tǒng)的優(yōu)勢，在改善患者依從性和提高患者生活質(zhì)量方面更具有獨特優(yōu)勢，從而在新藥的研發(fā)中占據(jù)有利地位[2,3]。

當歸和川牛膝均具有活血化瘀之功效，為中醫(yī)治療高血壓的常用中藥材，并常被研究人員進行單味中藥的藥理、成分研究，二者提取物中皆含有大量降壓成分，二者的提取物和水煎液均可使自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）的血壓降低。本課題組之前也針對當歸揮發(fā)油通過改善SHR脂代謝從而降壓的分子機制進行了研究[4,5]。然而，目前還沒有涉及當歸-川牛膝水煎液合劑的降壓療效以及藥理、成分的研究。因此，本研究以SHR為研究對象，對比了當歸-川牛膝水煎劑的不同提取成分對SHR血壓以及動脈血清中內(nèi)皮素（ET-1）、一氧化氮（NO）的表達的影響，對當歸-川牛膝水煎劑降壓的機制進行了初步探索，為進一步研究當歸-川牛膝降壓的有效成分及分子靶標奠定了基礎(chǔ)，同時也為當歸-川牛膝降壓的現(xiàn)代中藥指南制定提供了一定的借鑒依據(jù)。

1 材料

1.1 實驗動物

SPF級6周齡雄性SHR大鼠48只，體重（200±20）g，購自北京維通利華實驗動物公司，動物合格證號：SCXK（京）2016-0006；SPF級6周齡雄性Wistar大鼠6只，體重（200±20）g，購自甘肅中醫(yī)藥大學動物實驗中心，動物合格證號：SCXK（甘）2013-0002。飼養(yǎng)于甘肅中醫(yī)藥大學SPF級動物實驗中心，環(huán)境溫度（23.0±2.0）℃，相對濕度（35±5）%，換氣量10-20次·h-1，日光燈采光，明暗交替，常規(guī)充足飼料喂養(yǎng)，自由飲水，環(huán)境安靜。

1.2 實驗儀器

SY-2000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠），KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），DZKW型電子恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠），馬頭牌JYT-20A架盤藥物天平（上海醫(yī)用激光儀器廠），電子天平（賽多利斯科學儀器（北京）有限公司），DZF-6020MBE真空干燥箱（上海一恒科學儀器廠），Biofuge stratos高速冷凍離心機（美國科峻儀器公司），XH200型恒溫式無創(chuàng)血壓測量儀（上海玉研科學儀器有限公司）。

1.3 藥品及試劑

當歸和川牛膝飲片均購自甘肅省蘭州市西固區(qū)陳坪街道福利東路社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)站，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學藥學院趙磊教授鑒定分別為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根和莧科植物川牛膝Cyathula officimlisKuan的干燥根；纈沙坦膠囊（國藥準字：H20040217），購自甘肅中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院。

D-101型大孔吸附樹脂（滄州寶恩吸附材料科技有限公司），無水乙醇（分析純）（天津市永大化學試劑有限公司），制備當歸-川牛膝水煎劑分離物用；氫氧化鈉、濃鹽酸（天津大茂化學試劑廠），預處理大孔吸附樹脂用。

大鼠一氧化氮（NO）ELISA試劑盒（批號：MM-20607R1），大鼠內(nèi)皮素-1（ET-1）ELISA試劑盒（MM-0560R1），江蘇菲亞生物科技有限公司。

2 方法

2.1 藥物及配制

取等量當歸和川牛膝飲片，依據(jù)《中國藥典》（2010版）當歸常用量6-12 g，川牛膝常用量5-10 g，確定當歸-川牛膝用量為10 g:10 g，根據(jù)人和大鼠用藥劑量換算公式（參考徐叔云教授主編的《藥理實驗方法學》中人和動物間按體表面積折算的等效劑量比值），大鼠用藥劑量=人臨床用藥劑量/體重（kg）×6.3，故大鼠當歸-川牛膝用量為2.1 g·kg-1。按上述比例取生藥600 g，加水浸泡后煎煮2次，合并煎液，濾過，取1/2藥液濃縮干燥制成藥物干粉備用，以便后續(xù)配制原液；剩余1/2藥液濃縮再離心取上清液后經(jīng)大孔樹脂吸附，然后依次用水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇及90%乙醇洗脫，洗脫液減壓濃縮回收乙醇，獲取不同的分離物。相當于生藥材300 g的當歸-川牛膝水煎液經(jīng)干燥后最終得177.9084 g藥物干粉，得出率59.30%。相同質(zhì)量的水煎液經(jīng)大孔吸附樹脂純化分離，各分離組經(jīng)干燥最終所得藥物干粉分別為：水洗組121.0325 g、30%醇洗組4.5001 g、50%醇洗組1.0733 g、70%醇洗組0.9866 g、90%醇洗組0.0843 g，得出率分別為40.34%、1.50%、0.36%、0.33%、0.03%。30%乙醇洗脫組占總醇洗組分的比例最高，占總醇洗組分的67.73%，占總干粉質(zhì)量的2.53%。當歸-川牛膝水煎液經(jīng)大孔吸附樹脂純化分離，各分離組所得藥物量與生藥是等效的，由此得出各分離組的大鼠用藥量依次為：①水洗組SHR用量：2.1×40.34%≈0.8471 g·kg-1；②30%醇洗組SHR用量：2.1×1.50%≈0.0315 g·kg-1；③50%醇洗組SHR用量：2.1×0.36%≈0.0076 g·kg-1；④70%醇洗組SHR用量：2.1×0.33%≈0.0069 g·kg-1；⑤90%醇洗組SHR用量：2.1×0.03%≈0.0006 g·kg-1。水煎液組的SHR用量為2.1×59.30%≈1.2453 g·kg-1。取纈沙坦膠囊粉末用生理鹽水配制成混懸液備用，根據(jù)人和大鼠用藥劑量換算公式，計算出纈沙坦用藥量為8.4 mg·kg-1，按照1 mL/100 g的灌胃劑量，配制成0.84 mg·mL-1的混懸液。

2.2 動物分組及給藥方法

48只SHR大鼠隨機分為8組：即模型對照組、纈沙坦組、當歸-川牛膝組和分離組（水、30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇及90%乙醇），相配對的WKY大鼠為正常對照組，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后給藥。按照大鼠常規(guī)給藥劑量，依據(jù)大鼠體重，給藥量為1 mL/100 g。模型對照組和正常對照組給予生理鹽水，不給任何藥物；纈沙坦組給配制好的纈沙坦混懸液，各分離組給對應(yīng)的藥物分離物，每天定時給藥，每周給藥7 d，連續(xù)給藥4周，隨體重變化調(diào)整給藥劑量。

2.3 血壓測定及質(zhì)量控制

采用尾動脈容積無創(chuàng)血壓測量法測量清醒下的SHR血壓。將鼠尾與XH200型恒溫式無創(chuàng)血壓測量儀及MedLab MP1000生物信號采集處理系統(tǒng)的脈搏傳感器緊密相連，測定安靜、清醒狀態(tài)下的鼠尾動脈收縮壓，用藥前及用藥后每周均測血壓一次。實驗開始后，分別于給藥前、給藥1周、給藥2周、給藥3周、給藥4周測量大鼠血壓5次。測壓過程宜輕柔，避免激惹大鼠，造成血壓波動；鼠籠尺寸應(yīng)適合大鼠體型大小，避免大鼠在內(nèi)掙扎，影響數(shù)據(jù)準確性；加溫時間不宜過長，保持室溫穩(wěn)定，保證環(huán)境安靜[3]。

2.4 指標檢測

末次給藥后24 h，禁食不禁水12 h后，用3%戊巴比妥鈉（30 mg·kg-1）腹腔注射麻醉大鼠，采用腹主動脈采血法，取血8 mL，靜置后放入Biofuge stratos高速冷凍離心機，3500 r·min-1離心10 min，取出吸取上清液（即血清），分裝于2 mL EP管中，放于-20℃冰箱備用。采用酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）測定內(nèi)皮素（ET-1）和一氧化氮（NO）水平。

2.5 數(shù)據(jù)處理

3 結(jié)果

3.1 當歸-川牛膝水煎劑對SHR大鼠血壓的影響

治療前模型組、纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組較正常對照組血壓明顯偏高，差異均有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

治療1周纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組和正常對照組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療2周纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組和正常對照組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療3周纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組和正常對照組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療4周纈沙坦組和正常對照組比較無顯著差異（P>0.05），當歸-川牛膝組、各分離組和正常對照組比較均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

治療4周，纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組和模型組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05），纈沙坦組和正常對照組比較，無顯著差異（P>0.05），當歸-川牛膝組、30%醇洗組和纈沙坦組比較，無顯著差異（P>0.05），水洗組、50%醇洗組、70%醇洗組、90%醇洗組和纈沙坦組比較，均有顯著差異，差異具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表1）。

表1 各組大鼠血壓比較（±s，mmHg）（n=6）

表1 各組大鼠血壓比較（±s，mmHg）（n=6）

注：a.與正常對照組比較，P<0.05；b.各治療組與正常對照組比較，P<0.05；c.治療4周纈沙坦組、當歸-川牛膝組、各分離組和模型組比較，P<0.05；d1.治療4周纈沙坦組和正常對照組比較，P>0.05；d2.治療4周當歸-川牛膝組、30%醇洗組和纈沙坦組比較，P>0.05；d3.治療4周水洗組、50%醇洗組、70%醇洗組、90%醇洗組和纈沙坦組比較，P<0.05。

組別正常對照組模型組纈沙坦組當歸-川牛膝組水洗組30%醇洗組50%醇洗組70%醇洗組90%醇洗組治療前110.78±5.58 164.75±6.93a 163.37±6.96a 167.38±6.90a 162.79±6.35a 166.63±6.14a 164.38±6.08a 163.47±7.91a 165.62±5.76a治療1周111.72±6.02 164.12±8.41 149.07±6.62b 157.42±7.08b 157.45±6.49b 159.84±5.87b 160.24±6.04b 159.61±5.81b 160.49±5.82b治療2周109.52±5.99 163.37±7.67 139.68±6.22b 149.94±5.76b 150.72±6.07b 150.64±6.11b 153.35±6.57b 150.44±7.45b 153.62±6.25b治療3周108.92±5.01 165.78±6.79 130.28±7.15b 137.89±6.49b 143.65±5.97b 140.56±6.41b 142.85±7.10b 145.68±8.21b 146.76±5.97b治療4周108.86±5.89 168.16±5.91 116.09±6.56cd1 123.94±7.78bcd2 137.78±7.69bcd3 124.05±5.83bcd2 132.85±5.13bcd3 139.57±8.25bcd3 143.58±4.72bcd3

3.2 當歸-川牛膝水煎劑對SHR大鼠血清中ET-1和NO表達的影響

模型組ET-1水平明顯高于正常對照組，NO水平明顯低于正常對照組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；纈沙坦組、當歸-川牛膝組、30%醇洗組ET-1水平明顯低于模型組，NO水平明顯高于模型組，差異均具有統(tǒng)計學意義（P<0.05）（表2）。

表2 各組大鼠血液中ET-I、NO水平比較（n=6）

4 討論

中醫(yī)學無高血壓病名，屬“眩暈”、“頭痛”范疇，需根據(jù)證型來確定診療方法，其病機主要分為肝陽上亢、肝腎陰虛、陰虛陽亢、陰陽兩虛等。相關(guān)理論認為該病的病理產(chǎn)物以“痰飲”和“瘀血”為主，會導致經(jīng)脈氣血阻滯不通，血液、津液的運行不暢，停留在脈道內(nèi)勢必引起血液壓力的升高，形成高血壓疾病。筆者認為，當歸為常用的活血祛瘀藥，配合川牛膝的利水消腫之功，可以“去舊生新”，祛除血液、津液系統(tǒng)中的瘀阻，使人體氣機暢行，上下通調(diào)以使血壓恢復正常。兩味中藥的功用相輔相成，共同作用于血液和津液兩個系統(tǒng)，全面調(diào)節(jié)人體的氣血津液平衡，從根本出發(fā)降低血壓。

中藥當歸為傘形科植物當歸Angelica sinensis（Oliv.）Diels的干燥根，據(jù)文獻統(tǒng)計，當歸為治療高血壓使用率最高的中藥材之一[6]。現(xiàn)代研究表明[7]，當歸提取物通過對RASS系統(tǒng)、離子通道、血管神經(jīng)等方面對高血壓的發(fā)生發(fā)展產(chǎn)生一定的影響；其提取物降壓效果顯著，對微循環(huán)的加快、血黏度的降低、利尿、血脂的調(diào)節(jié)和免疫等方面都起到良好的作用[5,8]。當歸藥效成分研究顯示，其提取物中主要起降壓作用的成分為鞣酸、腺苷、?；撬岷桶⑽核岬?。當歸中阿魏酸能使小鼠心肌營養(yǎng)血流量增加，并穩(wěn)定缺氧心肌細胞膜，較大程度減輕細胞損傷[9]；含量僅為1%的揮發(fā)油成分藁本內(nèi)酯，可通過抑制ROCC和VOCC介導的主動脈平滑肌收縮實現(xiàn)降壓的效果；此外，5-羥甲基糠醛被發(fā)現(xiàn)與鞣酸、腺苷等成分共同作用，通過阻滯鈣離子通道、興奮中樞β、M受體、擴張小血管、降低腎素-血管緊張素活性等過程完成降壓的作用。

川牛膝為莧科植物川牛膝Cyathula officimlisKuan的干燥根，功善逐瘀通經(jīng)，也常用其與其他藥材配伍以降低血壓?，F(xiàn)代藥理研究證實，單味川牛膝也有一定的降血壓作用，其水煎液主要通過改善血管重構(gòu)，抗炎抗氧化應(yīng)激以及保護靶器官，改善心肌纖維化三個方面達到降低自發(fā)性高血壓大鼠（SHR）血壓的效果[3,10-12]。已有文獻報道[13]，氧自由基（OFR）在心血管疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要的促進作用，氧自由基可參與高血壓的形成、發(fā)展及其產(chǎn)生并發(fā)癥的全過程。實驗研究也表明[14]，川牛膝可通過上調(diào)體內(nèi)重要的抗氧化酶SOD來降低氧自由基含量，從而達到降低血壓的目的。

現(xiàn)代研究表明，腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)（RAS）的激活是高血壓發(fā)病的重要體液機制，血管緊張素原在腎素的作用下，水解而成的主要效應(yīng)物質(zhì)血管緊張素Ⅱ（AngⅡ）作用于AngⅡ受體，促進血管收縮和腎上腺皮質(zhì)分泌醛固酮，引起血壓增高[4]。此外，AngⅡ不僅能收縮小動脈血管，并可通過炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激誘導高血壓的發(fā)生。高血壓的治療可著眼于阻斷腎素血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)中的環(huán)節(jié)，如抑制AngⅡ的生成。目前對于高血壓的治療多將重點放在對ACEI的抑制，ACEI可抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶的表達，阻礙AngI轉(zhuǎn)換為AngⅡ，促進血管舒張。當歸能劑量性降低血清中腎素和AngⅡ的表達水平，并在改善心肌組織結(jié)構(gòu)，抑制心肌肥大具有良好療效[15]。王艷[16]等實驗結(jié)果表明，川牛膝具有抑制血管緊張素轉(zhuǎn)換酶表達的作用，從而阻斷AngⅡ生成，使血管舒張，進而血壓下降。

ET-1是目前發(fā)現(xiàn)作用最強的血管收縮肽和血流調(diào)節(jié)因子，ET-1的過表達引起的血管收縮、心肌缺血、代謝紊亂和細胞增殖是與血管損傷有關(guān)疾病的重要致病因素。NO是肺循環(huán)的血管擴張劑，能松弛血管平滑肌張力，在降低肺動脈阻力和維持肺血管擴張方面起著關(guān)鍵作用[17]。研究表明，原發(fā)性高血壓患者血漿NO濃度降低[18]，高血壓患者內(nèi)皮依賴性血管舒張功能受損[19]。研究已證實，吸入NO可減輕肺血管收縮[20]，并可提高肺動脈高壓大鼠模型的存活率[21]。高血壓的病機本質(zhì)是動脈血管的病變，血壓升高導致血管內(nèi)皮功能障礙，內(nèi)皮細胞產(chǎn)生和釋放的舒血管活性物質(zhì)和縮血管活性物質(zhì)失去原有的平衡，則會進一步加重高血壓。ET-1和NO是血管內(nèi)皮功能的重要指標，是一對非常重要的血管舒縮物質(zhì)，高血壓患者的血管內(nèi)皮細胞中ET-1表達增加，NO表達減少。因此，檢測血清中ET-1和NO的表達量可以簡單而有效地評估SHR的血壓變化情況。

本研究結(jié)果表示，纈沙坦、當歸-川牛膝水煎劑及其30%醇洗組均能有效降低SHR的血壓，并能降低ET-1的表達，升高NO的表達，表明當歸-川牛膝水煎劑及其提取物具有顯著地降壓作用，其變化趨勢和ET-1及NO的變化趨勢基本吻合，提示當歸-川牛膝水煎劑及其提取物可能是通過調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮細胞以及血液中ET-1和NO的平衡而實現(xiàn)降壓效果。

依據(jù)治療前后的血壓變化表，可以看出，治療1周后纈沙坦組的血壓下降程度較中藥組大，但治療2周、3周、4周的降壓效果有所減弱；而各中藥治療組每周的血壓變化基本相同，呈勻速降低趨勢。因此，我們認為西藥降壓見效雖快，但其療效不穩(wěn)定；中藥降壓較為緩慢，卻能保持一定的速率平穩(wěn)發(fā)展。由此可見，中藥降壓仍具有其獨特的優(yōu)勢。

比較當歸-川牛膝各分離組的降壓療效可以看出，以30%乙醇洗脫組為最佳，和當歸-川牛膝全藥組相當，效果優(yōu)于水洗組及高濃度醇洗組；對比模型組，各治療組在改善ET-1及NO這一對血管活性物質(zhì)方面，全藥組、30%醇洗組與纈沙坦組均具有顯著的效果，而其余治療組并無顯著差異。說明當歸-川牛膝在30%的乙醇溶液中能最大程度析出有效成分，可以包含原藥的絕大部分活性成分。后續(xù)我們可以針對當歸-川牛膝水煎液的30%醇洗組的成分進行檢測，以具體研究其降壓的活性物質(zhì)及作用靶標。

當歸和川牛膝作為單藥均被證實具有顯著地降壓效果，并對其作用機制的研究也比較多，但是，二者均具有活血化瘀通經(jīng)之功效，針對當歸-川牛膝合劑的降壓療效的研究尚屬少見，對其降壓的有效成分的報道也比較少。本研究僅對當歸-川牛膝水煎液降血壓的療效以及其對血管活性物質(zhì)的影響進行檢測，主要對比了不同提取方式其活性成分的降壓效果。然而，二者的降壓成分是否具有相似性，在藥效方面是否具有相互促進的作用？今后針對當歸-川牛膝降血壓的研究也可以圍繞這兩個方向展開。