王瑤瑤，陳昱江，楊 茂，陳云志

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院 廣州510403；2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院貴陽550001；3.貴州中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 貴陽550025）

心力衰竭（Heart Failure，HF）是一種復(fù)雜的臨床綜合征，主要表現(xiàn)為心臟泵血不能滿足機(jī)體組織器官的需要[1]。心力衰竭已成為我國心血管領(lǐng)域的重要公共衛(wèi)生問題，隨著年齡增長，老年患者心力衰竭的發(fā)病率及死亡率也隨之增高[2]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，胰島素抵抗（insulin resistance，IR）與心力衰竭的風(fēng)險(xiǎn)增加密切相關(guān)[3]，因此改善心力衰竭胰島素抵抗的治療是目前醫(yī)學(xué)研究的重點(diǎn)。

中醫(yī)認(rèn)為HF的病位雖然在心，但人體是一個(gè)統(tǒng)一的有機(jī)整體，心臟受損可累及五臟，如心陽虛損，窮必極腎。陳可冀[4]認(rèn)為，慢性心衰最根本的病機(jī)為內(nèi)虛，早期主要為心氣心陽虧虛，瘀血內(nèi)停；中期脾陽受損，水濕內(nèi)停；后期腎陽虛衰，水飲泛濫。心腎陰陽之間存在著密切的關(guān)系，心之陽氣有賴腎陽資助，心陽虛日久及腎，腎陽不足致心失溫養(yǎng)，故心衰治療常要補(bǔ)腎益氣。前期基礎(chǔ)研究[5]發(fā)現(xiàn)益氣活血方藥能一定程度逆轉(zhuǎn)心衰大鼠的IR并改善心室重構(gòu)，但補(bǔ)腎益氣方藥對心衰胰島素抵抗的研究未見報(bào)道，故本研究進(jìn)一步探討補(bǔ)腎益氣方藥對心衰大鼠胰島素抵抗的影響作用及分子機(jī)制，為中醫(yī)藥治療心力衰竭具有多靶點(diǎn)作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)用藥

補(bǔ)腎益氣方藥由淫羊藿20 g、黃芪20 g、黨參15 g、麥冬10 g、五味子10 g組成，藥材混合后加700 mL水浸泡半小時(shí)，濾出煎液，再加300 mL水煎煮，煮沸后半小時(shí)濾出，將兩次濾液懸蒸濃縮成1∶2煎液，每毫升含生藥2 g，儲(chǔ)存于玻璃瓶，4℃保存?zhèn)溆?，以上中藥均購于貴陽同濟(jì)堂藥店。鹽酸阿霉素（購于上海伊卡生物技術(shù)有限公司，產(chǎn)地：美國，規(guī)格：25 mg/瓶，CAS號(hào)：25316-40-9，MDL號(hào):MFCD00077757）；卡托普利（生產(chǎn)企業(yè)：常州制藥廠有限公司，規(guī)格：25 mg*100片/盒，國藥準(zhǔn)字H32023731）。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑及主要儀器

胰島素試劑盒（產(chǎn)地：瑞典，購于北京優(yōu)尼康生物科技有限公司，規(guī)格：96 wells）；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（Real-time PCR）試劑購自寶生物工程有限公司，TRNzol總RNA提取試劑購自天根生化科技（北京）有限公司，引物設(shè)計(jì)由賽默飛世爾科技完成；蛋白激酶B（PKB/AKT）和脂聯(lián)素蛋白抗體購自康為世紀(jì)有限公司。電泳儀、蛋白電泳槽、蛋白轉(zhuǎn)印系統(tǒng)（BIO-RAD公司），酶標(biāo)儀（北京新風(fēng)機(jī)電）；凝膠成像系統(tǒng)（儀器型號(hào)：Tanon 1600，上海天能科技有限公司）、熒光定量PCR儀（儀器型號(hào)：ABI7500，Applied Biosystems）。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物造模及分組

清潔級(jí)10周齡Wistar雄性大鼠60只，體重200-250 g（長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，動(dòng)物合格證號(hào)：43006700008480），將其隨機(jī)分為空白對照組、模型組、心力衰竭模型+卡托普利組、心力衰竭模型+補(bǔ)腎益氣方藥低劑量組、心力衰竭模型+補(bǔ)腎益氣方藥中劑量組、心力衰竭模型+補(bǔ)腎益氣方藥高劑量組。心力衰竭模型組及藥物組分別予阿霉素腹腔注射，阿霉素劑量按每次20㎎·㎏-1溶于注射用水0.5 mL中，腹腔注射，隔天1次，共6次，總劑量為120㎎·㎏-1于2周內(nèi)注射，給藥期間大鼠出現(xiàn)精神萎靡，懶動(dòng)，飲食量降低，豎毛，氣喘，吐粉紅色泡沫等體征[6]。造模成功后（心臟超聲檢測射血分?jǐn)?shù)，以EF<45%為模型成功），藥物組分別給予灌胃?？ㄍ衅绽M：將卡托普利充分溶解于蒸餾水中，按照25 mg/（kg·d)比例配置，2 mL/只灌胃;補(bǔ)腎益氣方高劑量組給予8 g/（kg·d）、補(bǔ)腎益氣方中劑量組給予6 g/（kg·d）益、補(bǔ)腎益氣方低劑量組給予4 g（kg·d），2 mL/只灌胃，連續(xù)給藥2周；正常組和模型組給予同體積蒸餾水灌胃。

1.2 方法

1.2.1 空腹血糖、空腹胰島素測定與胰島素敏感指數(shù)計(jì)算

給藥結(jié)束后，禁食12 h，內(nèi)眥靜脈竇取血3 mL，3000 r·min-1離心15 min，收集上清，低溫冰箱保存?zhèn)溆??？崭寡牵‵BG）測定用葡萄糖氧化酶法測定，空腹胰島素（FINS）用放射免疫法測定。胰島素抵抗（IR）的指標(biāo)用由美國NIH肺、心臟血壓研究所的Katz于2000年提出的胰島素敏感指數(shù)（ISI）表示：ISI=ln[1/(FBG*FINS)]。

1.2.2 Western blot方法檢測PKB/AKT、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)

從-80℃冰箱中取各組大鼠的心臟、骨骼肌和肝臟組織，盡可能剪碎，進(jìn)行蛋白裂解、勻漿，4℃離心機(jī)3000 r，15 min，提取上清，用BCA法及酶標(biāo)儀測定各樣本吸光值，計(jì)算各樣本蛋白含量；根據(jù)檢測的目的蛋白分子量大小，選擇不同的分離膠濃度，SDS-PAGE分離膠的濃度進(jìn)行SDS-PAGE灌膠，然后將樣本及預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)品蛋白加入及電泳系統(tǒng)、裁剪合適大小的PVDF膜，并包含目的蛋白分子量條帶的凝膠，置于濾紙之上；將PVDF膜與凝膠對齊并去除氣泡，再蓋上濾紙和海綿墊，合上夾子；將夾子放入轉(zhuǎn)移槽中，冰水浴，加入電轉(zhuǎn)液，220MA恒流，低溫轉(zhuǎn)膜2 h。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，用一步法快速WB試劑盒進(jìn)行免疫反應(yīng)，ECL化學(xué)發(fā)光和曝光顯影，最后用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目的蛋白分子量和凈光密度值。

1.2.3 RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測PKB（AKT1）mRNA、脂聯(lián)素（Adipoq）mRNA

各組樣本加入RNAiso Plus，室溫放置5 min；加1/5RNAiso Plus體積量氯仿混勻，冰上放置5 min；12000 r·min-14℃離心15 min，取上清于另一離心管中；加入等體積異丙醇，冰上放置10 min；12 000 r·min-14℃離心10 min，棄上清；向沉淀加入75%乙醇1 mL洗滌，12000 r·min-1，4℃離心5 min，棄上清，干燥沉淀；加入適量RNase-free水溶解沉淀，按照M-MLV RTase cDNA Synthesis試劑盒說明書配制反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為37℃15 min，85℃5 s，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA。按照SYBR Master Mixture試劑盒說明書配制PCR反應(yīng)液及設(shè)置反應(yīng)條件，進(jìn)行實(shí)時(shí)定量PCR檢測，β-actin作為內(nèi)參，同時(shí)設(shè)RT質(zhì)控和PCR擴(kuò)增兩個(gè)空白對照。根據(jù)目的基因與內(nèi)參基因的Ct差值得出各組相應(yīng)指標(biāo)mRNA的相對表達(dá)量（表1）。

表1 各基因引物系列

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件（IBM，Armonk，NY，USA）。先用Kolmogorov-Smirnov test檢驗(yàn)是否符合正態(tài)分布，符合正態(tài)分布實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（M±SD）表示，兩兩間比較運(yùn)用pos-thoc Student-Newman-Keuls test檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 補(bǔ)腎益氣方藥對FBG、FIS與ISI的影響

與空白對照組比較，模型組空腹血糖（FBG）、空腹血清胰島素（FIS）顯著升高（P<0.01），胰島素敏感指數(shù)（ISI）顯著降低，統(tǒng)計(jì)學(xué)具有顯著差異（P<0.01）；經(jīng)藥物治療后，與模型組相比，補(bǔ)腎益氣方藥各劑量組與卡托普利組空腹血糖（FBG）變化不明顯、空腹血清胰島素（FIS）均明顯降低（P<0.05），胰島素敏感指數(shù)（ISI）均明顯升高，其中卡托普利組及補(bǔ)腎益氣方藥高劑量組空腹血清胰島素（FIS）顯著降低（P<0.01），卡托普利組胰島素敏感指數(shù)（ISI）升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異（P<0.01）（表2）。

表2 補(bǔ)腎益氣方藥對FBG、FIS與ISI的影響（xˉ響氣方藥）

2.2 補(bǔ)腎益氣方藥對心臟、肝臟和骨骼肌PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)的影響

模型組大鼠心臟、肝臟和骨骼肌中PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)的灰度值較對照組明顯降低（P<0.001），卡托普利組心臟、肝臟和骨骼肌中PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)的灰度值較模型組明顯升高，各中藥組心臟、肝臟和骨骼肌中PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)的灰度值逐漸升高，以補(bǔ)腎益氣方藥高劑量組灰度值升高較為明顯（圖1，圖2，圖3）。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：與空白對照組比較，模型組PKB、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.01），與模型組比較，補(bǔ)腎益氣方藥各劑量組及卡托普利組蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.01，P<0.05）（表3）。

圖2 肝臟PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的蛋白表達(dá)

圖3 骨骼肌PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的蛋白表達(dá)

2.3 補(bǔ)腎益氣方藥對心臟、肝臟和骨骼肌PKBmRNA、脂聯(lián)素mRNA的影響

與空白對照組比較，模型組PKB、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)水平顯著下降（P<0.01），與模型組比較，補(bǔ)腎益氣方藥各劑量組及卡托普利組蛋白表達(dá)水平明顯升高（P<0.05，P<0.01），高劑量組及卡托普利組PKB、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)明顯升高（P<0.01）（表4）。

圖1 心臟PKB/AKT1、脂聯(lián)素蛋白的蛋白表達(dá)

表3 心臟、肝臟、骨骼肌中脂聯(lián)素、AKT1蛋白表達(dá)（±s）

表3 心臟、肝臟、骨骼肌中脂聯(lián)素、AKT1蛋白表達(dá)（±s）

注：與N組比較，**P<0.01；與M組比較，▲▲P<0.01，▲P<0.05。

組別空白對照組模型組卡托普利組補(bǔ)腎益氣方藥低劑量組補(bǔ)腎益氣方藥中劑量組補(bǔ)腎益氣方藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10心臟脂聯(lián)素1.359±0.027 0.341±0.027**1.085±0.042 0.578±0.027▲▲0.633±0.040▲▲1.061±0.031▲▲△△AKT1 1.256±0.026 0.324±0.023**1.099±0.042 0.493±0.044▲▲0.532±0.029▲▲0.859±0.026▲▲△△肝臟脂聯(lián)素1.337±0.017 0.312±0.011**1.087±0.053 0.644±0.030▲▲0.672±0.016▲▲0.750±0.028▲▲△△AKT1 1.353±0.030 0.334±0.024**1.246±0.024 0.651±0.025▲▲0.686±0.042▲▲0.850±0.024▲▲△△骨骼肌脂聯(lián)素0.836±0.024 0.200±0.018**0.699±0.031 0.338±0.024▲▲0.420±0.024▲▲0.553±0.026▲▲△△AKT1 0.0939±0.023 0.415±0.019**0.850±0.030 0.441±0.026▲0.508±0.039▲▲0.747±0.032▲▲△△

表4 心臟、肝臟、骨骼肌中脂聯(lián)素mRNA、AKT1 mRNA表達(dá)（±s）

表4 心臟、肝臟、骨骼肌中脂聯(lián)素mRNA、AKT1 mRNA表達(dá)（±s）

注：與N組比較，**P<0.01；與M組比較，▲▲P<0.01，▲P<0.05；與P組比較，△△P<0.01，△P<0.05。

組別空白對照組模型組卡托普利組補(bǔ)腎益氣方藥低劑量組補(bǔ)腎益氣方藥中劑量組補(bǔ)腎益氣方藥高劑量組n 10 10 10 10 10 10脂聯(lián)素mRNA心臟6.70±1.11 1.05±0.56**5.65±0.71▲▲1.71±0.23▲▲3.69±0.72▲▲4.20±0.55△△肝臟6.86±1.12 0.80±0.28**5.33±0.38▲▲1.87±0.45▲▲3.49±0.80▲▲4.34±0.59△△骨骼肌5.47±0.73 0.68±0.24**4.59±0.66▲▲1.75±0.42▲▲2.52±0.57▲▲3.55±0.68△△AKT1mRNA心臟6.87±1.65 0.82±0.37**5.30±1.25▲▲1.97±0.47▲▲3.58±0.92▲▲4.16±0.88△肝臟6.33±1.41 0.90±0.28**5.45±0.79▲▲1.93±0.33▲▲3.50±0.70▲▲4.52±0.63△骨骼肌5.53±1.32 0.88±0.20**4.66±0.47▲▲1.44±0.35▲▲3.73±0.97▲▲3.97±0.62△

3 討論

充血性心力衰竭在中醫(yī)屬“心痹”、“心悸”、“喘證”、“痰飲”、“水腫”等范疇，其病機(jī)主要為本虛標(biāo)實(shí)，以心腎陽虛為本，血脈瘀滯、水飲內(nèi)停、痰濁不化為標(biāo)。心陽與腎陽之間有著密切的關(guān)系，心之陽氣有賴腎陽資助，心陽虛日久可累及腎陽，腎陽不足致心失溫養(yǎng)，故中醫(yī)治療本病常從補(bǔ)腎益氣著手[7]。胰島素抵抗是心力衰竭發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。心衰時(shí)胰島素抵抗發(fā)生的分子機(jī)制主要有胰島素信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)障礙及相關(guān)脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)異常等原因。本研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)腎益氣方藥可能通過改變磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號(hào)通路及脂肪細(xì)胞因子的表達(dá)，有效改善心衰時(shí)的胰島素抵抗。

心肌細(xì)胞內(nèi)胰島素信號(hào)傳導(dǎo)通路的激活是心力衰竭發(fā)生胰島素抵抗的重要機(jī)制[8]。胰島素抵抗（IR）是由于胰島素靶器官對內(nèi)源性或外源性胰島素的敏感性和反應(yīng)性降低，導(dǎo)致靶器官細(xì)胞內(nèi)的糖、脂質(zhì)及蛋白質(zhì)代謝障礙而出現(xiàn)的一系列綜合征。心血管系統(tǒng)也是胰島素作用的靶器官，胰島素抵抗可引起微血管病變、外周動(dòng)脈功能障礙、血流受阻、高血壓、心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙，從而增加冠狀動(dòng)脈阻塞、卒中和心力衰竭的危險(xiǎn)因素，IR與心血管疾病密切相關(guān)。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號(hào)通路是胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最主要的途徑[9]。胰島素與心肌細(xì)胞膜上的胰島素受體（InsR）結(jié)合后，可以激活胰島素受體底物-1（IRS-1），活化的IRS-1繼續(xù)激活PI3K，使其下游的信號(hào)分子PKB磷酸化，完成心肌細(xì)胞內(nèi)胰島素的信號(hào)傳導(dǎo)[10]。當(dāng)磷脂酰肌醇-3-羥激酶/蛋白激酶B（PI3K-PKB）信號(hào)通路受阻時(shí)，可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞線粒體內(nèi)的氧化應(yīng)激及心肌細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致心衰的發(fā)生。脂肪因子失調(diào)也是胰島素抵抗的一個(gè)重要特征。脂聯(lián)素是脂肪細(xì)胞分泌的一種細(xì)胞因子，具有增強(qiáng)胰島素敏感性，降低胰島素抵抗，減少心肌損害，改善心衰發(fā)展過程中心臟結(jié)構(gòu)和功能的作用[11]。脂聯(lián)素能有效調(diào)節(jié)血清脂質(zhì)水平，降低血糖，保護(hù)心血管，抑制動(dòng)脈粥樣硬化。脂聯(lián)素還可以抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子的表達(dá)和分泌，如腫瘤壞死因子，從而降低胰島素抵抗[12]。前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)心衰大鼠存在胰島素抵抗（IR），因此選擇心衰大鼠的心臟、肝臟和骨骼肌作為目標(biāo)組織，以PI3K-PKB信號(hào)傳導(dǎo)通路及脂肪因子分泌改變作為切入點(diǎn)觀察補(bǔ)腎益氣方藥對心衰IR的作用機(jī)制。胰島素抵抗是心衰發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素，高胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)可能通過胰島素的促生長作用導(dǎo)致心臟重塑和心室功能障礙加重心衰，且與PI3K-PKB信號(hào)傳導(dǎo)通路障礙及脂聯(lián)素的分泌有關(guān)[13]。這與本研究的模型建立及研究思路相符合。

胰島素抵抗（IR）屬中醫(yī)的“消渴”，腎氣虛是其發(fā)病之本，津涸液燥為發(fā)病之標(biāo)。目前臨床針對心衰時(shí)胰島素抵抗的治療，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)并沒有統(tǒng)一的治療原則，多用常規(guī)抗心衰藥物聯(lián)合胰島素增敏劑，但兩類藥物合用時(shí)常相互拮抗，臨床應(yīng)用存在一定的局限性，而中醫(yī)藥較西醫(yī)治療心衰時(shí)胰島素抵抗具有全方位、多途徑的優(yōu)勢且成效顯著[14]。因此本研究選用補(bǔ)腎益氣方改善充血性心力衰竭胰島素抵抗。補(bǔ)腎益氣方藥由淫羊藿、黃芪、人參、麥冬、五味子組成。方中黃芪、人參益氣養(yǎng)心，淫羊藿溫陽補(bǔ)腎，為君藥，麥冬、五味子養(yǎng)陰生津，為臣藥，諸藥合用共奏補(bǔ)腎益氣、滋陰生津的功效。研究發(fā)現(xiàn)黃芪多糖小檗堿（APBBR）可能通過下調(diào)IR-INS-1細(xì)胞miR-126-3p的表達(dá)從而增加IRS1 mRNA水平及其蛋白的表達(dá)，改善胰島素抵抗[15]；人參皂苷可激活胰島素信號(hào)通路，上調(diào)PI3K表達(dá)，有效促進(jìn)PI3K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)下游的葡萄糖攝取和轉(zhuǎn)運(yùn)，逆轉(zhuǎn)胰島素抵抗[16]；淫羊藿總黃酮（TFE）能增加胰島素敏感性，明顯改善胰島素抵抗相關(guān)因子的表達(dá)[17]；麥冬提取物可通過下調(diào)miRNA-29a，上調(diào)FOXO3表達(dá)明顯改善胰島素抵抗[18]；五味子油對2型糖尿病大鼠有降低血糖，調(diào)節(jié)血脂代謝紊亂，改善胰島素抵抗的作用[19]

綜上所述，補(bǔ)腎益氣方可有效改善充血性心力衰竭大鼠的胰島素抵抗，增加胰島素抵抗過程中PKB、脂聯(lián)素蛋白表達(dá)，保護(hù)心肌細(xì)胞，改善心功能。磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（PKB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路出現(xiàn)障礙及細(xì)胞因子分泌失衡可能是心衰時(shí)胰島素抵抗的重要分子機(jī)制，中醫(yī)藥在改善心力衰竭胰島素抵抗的分子機(jī)制中具有多途徑的作用，但本研究的中藥復(fù)方成分復(fù)雜，研究存在一定的局限性，因此中醫(yī)藥改善心衰時(shí)胰島素抵抗的分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。