馬倩雯，談 勇

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)鎮(zhèn)江附屬醫(yī)院，鎮(zhèn)江市中醫(yī)院 婦科 江蘇 鎮(zhèn)江212000中國(guó)；2.南京中醫(yī)藥大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院 江蘇 南京210000中國(guó)）

近年來(lái)，人工光源的廣泛使用，給人們帶來(lái)便利的同時(shí)，也正在成為一種新的污染源—光污染。光污染影響到了人們的正常生活[1-3]，對(duì)人體在不同程度上有著一定的傷害，從而使一系列疾病的患病機(jī)率增加，表現(xiàn)在女性生殖系統(tǒng)方面的疾病如月經(jīng)不調(diào)、排卵障礙性疾病、不孕癥等[4-6]。MicroRNA（miRNA)是一類(lèi)非編碼RNA，能通過(guò)與靶mRNA特異性的堿基互補(bǔ)配對(duì)引起靶mRNA的降解或遏制其翻譯，在多種疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了重要的調(diào)節(jié)作用[7-13]。研究表明，許多重要的生物學(xué)進(jìn)程研究發(fā)現(xiàn)多種疾病中均存在microRNA的差異表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)采用持續(xù)光照的方法建立大鼠光照節(jié)律紊亂模型模擬光污染的環(huán)境，通過(guò)對(duì)大鼠卵巢microRNA測(cè)序表達(dá)譜的分析，從而探討這種環(huán)境影響因素對(duì)大鼠卵巢microRNA的影響以及滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法的干預(yù)作用，為臨床治療和預(yù)防提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

2 月齡SD大鼠80只，體重200±20 g，飼養(yǎng)于南京中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物中心，室內(nèi)濕度為55%～70%，室內(nèi)溫度為22～24℃。

1.2 主要試劑與儀器

Agilent 2100生物分析儀（Agilent Technologies，2100），NEBNext? Multiplex Small RNA library Prep Set for Illumina?試劑盒（New England BioLabs，E7300L），Trizol（Thermo Fisher Scientific，15596018），PrimeScript RT-PCR Kit（Takara，RR014A）和Premix EX Taq（Takara，DRR041A），ABI7500熒光定量PCR儀（ABI，7500），核酸蛋白濃度分析儀（美林恒通公司，SMA4000），4只40 W白熾燈（科導(dǎo)公司，E27）、微量加樣器（Eppendorf），滋陰補(bǔ)陽(yáng)序貫中藥（經(jīng)后期方藥組成如下：當(dāng)歸10 g、山茱萸6 g、白芍10 g、菟絲子12 g、干地黃10 g、紫河車(chē)10 g；經(jīng)前期方藥組成如下：巴戟天10 g、續(xù)斷15 g、補(bǔ)骨脂10 g、淫羊藿10 g、黨參15 g、淮山藥15 g）（江蘇省中醫(yī)院），奧林巴斯CX22顯微鏡（OLYMPUS，CX22）、?，擜S823高精度光強(qiáng)測(cè)試儀（深圳市源恒通科技有限公司，AS823）。

2 方法

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

將80只SD雌性大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組25只和造模組55只，對(duì)照組大鼠25只予12小時(shí)光/12小時(shí)暗的光照環(huán)境，而造模組大鼠55只予24小時(shí)持續(xù)光照的光照環(huán)境，造模時(shí)間定為50天，去除造模失敗大鼠5只，剩余大鼠分為模型組25只及實(shí)驗(yàn)組25只。對(duì)照組和模型組給予生理鹽水灌胃，而實(shí)驗(yàn)組予滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫中藥治療。實(shí)驗(yàn)組根據(jù)大鼠陰道脫落細(xì)胞涂片來(lái)辨別大鼠動(dòng)情周期，并給予相應(yīng)的中藥灌胃，即動(dòng)情期和動(dòng)情前期給予滋陰方灌胃，動(dòng)情間期及動(dòng)情后期則給予補(bǔ)陽(yáng)方治療，若持續(xù)使用3天以上滋陰方后仍舊沒(méi)有轉(zhuǎn)為動(dòng)情間期或者動(dòng)情后期，則改成補(bǔ)陽(yáng)方灌胃治療，同樣，若持續(xù)使用3天以上補(bǔ)陽(yáng)方后仍舊沒(méi)有轉(zhuǎn)成動(dòng)情期或者動(dòng)情前期，則改成滋陰方灌胃，每天1次，共20天，給藥劑量按照人與大鼠體表面積折算的比率1∶0.018算出。與此同時(shí)，模型組給予大鼠等體積的生理鹽水灌胃。每10天對(duì)三組大鼠進(jìn)行稱(chēng)重一次。20天持續(xù)治療后隨機(jī)選取三組大鼠中的5只進(jìn)行糖水偏好實(shí)驗(yàn)以及強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)，其它大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血和卵巢的取樣。依據(jù)大鼠陰道涂片找出動(dòng)情前期的大鼠進(jìn)行腹主動(dòng)脈取血，剖腹留取卵巢組織并對(duì)卵巢組織進(jìn)行稱(chēng)重，然后將大鼠處死。所有大鼠于14:00處死。卵巢組織放入凍存管內(nèi)，置于-80℃冰箱中，凍存待檢。

2.2 卵巢組織總RNA的提取以及質(zhì)量鑒定

提取三組大鼠的卵巢組織RNA，接著對(duì)總RNA進(jìn)行質(zhì)量測(cè)定。采用瓊脂糖凝膠電泳鑒定RNA完整性，然后使用核酸蛋白濃度分析儀檢測(cè)三組大鼠卵巢組織的RNA的濃度，將樣本稀釋50倍分別測(cè)定260 nm和280 nm波長(zhǎng)的吸光度值，計(jì)算OD260/OD280的比值，1.8-2.0之間認(rèn)為RNA純度達(dá)標(biāo)。初步測(cè)定完成后，避免降解產(chǎn)物的污染，用Agilent 2100生物分析儀進(jìn)行質(zhì)檢，確?？俁NA的濃度及完整性達(dá)到測(cè)序要求，提取的RNA于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

取RIN（RNA完整性計(jì)數(shù)）大于8的2μg總RNA進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建。具體過(guò)程如下：使用3′連接酶將3′SR接頭連到小RNA上，為防止接頭二聚體產(chǎn)生，剩余的3′SR接頭會(huì)與Illumina SR RT引物雜交。再使用5′連接酶將5′SR接頭連到小RNA上，用ProtoScript II反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA的第一條鏈。然后用P5和P7引物擴(kuò)增12個(gè)循環(huán)。構(gòu)建好的文庫(kù)經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳純化回收140 bp左右的片段，使用Agilent 2100生物分析儀檢測(cè)文庫(kù)質(zhì)量，并通過(guò)Qubit 2.0 Fluorometer對(duì)文庫(kù)定量。不同標(biāo)記的DNA文庫(kù)混合后，進(jìn)行1×50 bp單端測(cè)序，并讀取序列信息。

2.4 MicroRNA的差異表達(dá)分析

應(yīng)用DESeq（v1.18.0）軟件對(duì)三組大鼠卵巢已知microRNA表達(dá)進(jìn)行差異比較，統(tǒng)計(jì)microRNA差異表達(dá)的上下調(diào)狀況。

2.5 GO和KEGG顯著性富集分析

GO是一種基因分類(lèi)，可以用來(lái)闡述基因的細(xì)胞功能、分子成分以及所參與的生物學(xué)過(guò)程。GO顯著性富集分析可以在差異表達(dá)microRNA的靶基因中給出顯著富集的生物學(xué)功能，即microRNA靶基因與哪些生物學(xué)功能顯著相關(guān)。KEGG是和信號(hào)通路相關(guān)的數(shù)據(jù)庫(kù)，KEGG的顯著性富集分析可以在差異表達(dá)microRNA的靶基因中找出顯著富集的信號(hào)通路。

2.6 差異表達(dá)microRNA的驗(yàn)證

應(yīng)用RT-PCR（熒光定量PCR）的實(shí)驗(yàn)方法對(duì)顯著差異表達(dá)的microRNA進(jìn)行測(cè)定，從而判斷高通量測(cè)序結(jié)果是否可靠。由上海生工生物科技有限公司設(shè)計(jì)引物，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，根據(jù)試劑盒說(shuō)明，配制逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，所得cDNA于-20℃保存。所有基因熒光定量PCR按20μl反應(yīng)體系進(jìn)行。所有基因熒光定量PCR按20μl反應(yīng)體系進(jìn)行。反應(yīng)結(jié)束后，熒光定量PCR儀測(cè)定出Ct值，△Ct是指目的基因Ct值與內(nèi)參Ct值的差值，并計(jì)算microRNA相對(duì)表達(dá)量的2-??Ct值。采用熒光定量RT-PCR對(duì)4個(gè)顯著差異表達(dá)的microRNA（miR-344a、miR-466b-5p、miR-466c-3p、miR-421-5p）進(jìn)行驗(yàn)證，以rRNA U6（上游引物為T(mén)GACACGCAAATTC?GTGAAGCGTTC，下游引物為CCAGTCTCAGGGTCC?GAGGTATTC）作為內(nèi)參，上游引物序列miR-344a:GCGGCGGUCAGGCUCCUGGCUA；miR-466b-5p：GGC?GGUAUGUGUGUGUGUAUGUC；miR-466c-3p：GCG?GCGGUAUACAUGCACACAUAC；miR-421-5p:CGGC?GGGGCCUCAUUAAAUGUUU。下游通用引物序列為CAGTGCAGGGTCCGAGGTAT。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 24.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，三組之間的比較運(yùn)用單因素方差分析的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，不符合正態(tài)分布或者方差不齊者，采用非參數(shù)檢驗(yàn)的辦法，其中P<0.05提示比較者之間具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1 高通量測(cè)序數(shù)據(jù)

原始序列經(jīng)過(guò)處理后，模型組、實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組大鼠卵巢樣本所獲得的可用于分析的小RNA序列數(shù)量分別為16733978、16776253和13724423 reads。對(duì)所測(cè)序列長(zhǎng)度在18-32 nt之間的序列進(jìn)行分布統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)測(cè)序得到的序列在18-32 nt的reads，主要集中在20-24 nt，在22 nt處出現(xiàn)最高峰，符合microRNA的長(zhǎng)度特征。結(jié)果表明，測(cè)序數(shù)據(jù)準(zhǔn)確可靠，可以用于后續(xù)的生物信息學(xué)分析。

3.2 差異性表達(dá)microRNA的分析

3.2.1 對(duì)照組與模型組已知microRNA差異性表達(dá)的分析 對(duì)照組與模型組對(duì)照比較顯示16個(gè)已知mi?croRNA呈顯著差異性表達(dá)，其中5個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，其中包括miR-421-5p、miR-326-5p、miR-208a-5p、miR-338-5p和miR-541-5p，11個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào)，包括miR-132-5p、miR-146b-5p、miR-466c-3p、miR-212-5p、miR-466b-5p、miR-21-5p、miR-6329、miR-96-5p、miR-344a、miR-31a-5p、miR-877。

3.2.2 實(shí)驗(yàn)組與模型組已知microRNA差異性表達(dá)的分析 實(shí)驗(yàn)組與模型組對(duì)照比較顯示4個(gè)已知mi?croRNA呈顯著差異性表達(dá)，其中3個(gè)microRNA表達(dá)上調(diào)，其中包括miR-466b-5p、miR-466c-3p、miR-344a，1個(gè)microRNA表達(dá)下調(diào)，其中包括miR-421-5p。

三組大鼠卵巢差異性表達(dá)microRNA的上下調(diào)情況見(jiàn)圖1。

圖1 三組大鼠卵巢差異性表達(dá)microRNA的上下調(diào)情況

3.3 模型組與對(duì)照組之間的GO和KEGG功能分析

通過(guò)對(duì)模型組與對(duì)照組之間進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析可知，光污染引起的卵巢差異表達(dá)的microRNA及可能的靶基因在富集的分子功能上多集中于生物調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)過(guò)程、分子的結(jié)合等方面，受microRNA調(diào)控的靶基因參與的這些通路中多集中于神經(jīng)組織受體相互作用、癌癥、雌激素、MAPK等相關(guān)信號(hào)通路，見(jiàn)圖2-3。

圖2 對(duì)照組與模型組比較的GO分析圖

3.4 實(shí)驗(yàn)組與模型組之間的GO和KEGG功能分析

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)組與模型組之間進(jìn)行GO分析和KEGG通路富集分析可知，滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法可能通過(guò)癌癥、雌激素、MAPK等相關(guān)信號(hào)通路作用于卵巢組織起到改善卵巢功能的作用，見(jiàn)圖4-5。

3.5 熒光定量RT-PCR驗(yàn)證

通過(guò)對(duì)照組與模型組以及實(shí)驗(yàn)組與模型組的綜合比較分析，我們得出有4個(gè)microRNA在這兩個(gè)組間共同呈顯著差異表達(dá)，且在對(duì)照組與模型組中呈現(xiàn)上調(diào)的microRNA在實(shí)驗(yàn)組與模型組中呈現(xiàn)下調(diào)，在對(duì)照組與模型組中呈現(xiàn)下調(diào)的microRNA在實(shí)驗(yàn)組與模型組中呈現(xiàn)上調(diào)，我們分析這共同的microRNA可能參與光污染影響卵巢發(fā)育以及滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法干預(yù)作用的過(guò)程。因此我們對(duì)這4個(gè)microRNA進(jìn)行熒光定量RT-PCR測(cè)定。

熒光定量RT-PCR結(jié)果顯示4個(gè)microRNA表達(dá)的變化趨勢(shì)與高通量測(cè)序的結(jié)果一致，即模型組miR-344a、miR-466b-5p、miR-466c-3p顯著低于實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，模型組miR-421-5p顯著高于實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組，進(jìn)一步證實(shí)了高通量測(cè)序結(jié)果的準(zhǔn)確性，見(jiàn)圖6-7。

4 討論

近年來(lái)，人工光源的廣泛使用為人們的生活提供了便利，但夜間照明時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)使人體接受光照的時(shí)間和強(qiáng)度延長(zhǎng)，可導(dǎo)致內(nèi)分泌失調(diào)、晝夜節(jié)律紊亂、生殖功能障礙。有文獻(xiàn)報(bào)道，夜班、輪班工作者，月經(jīng)不調(diào)、不孕癥等疾病的發(fā)病率增高。光照時(shí)間過(guò)長(zhǎng)或光照強(qiáng)度過(guò)強(qiáng)，會(huì)引起下丘腦-垂體-卵巢軸的異常，影響人類(lèi)的生命健康[14-15]。

圖3 對(duì)照組與模型組比較的KEGG圖

本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)方法來(lái)探討光污染引起的差異表達(dá)的microRNA及可能的靶基因，進(jìn)一步推測(cè)microRNA在光污染環(huán)境下的作用機(jī)理，同時(shí)探討滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法對(duì)卵巢功能在microRNA水平上的改善作用。滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法是根據(jù)國(guó)醫(yī)大師夏桂成教授的調(diào)周理論提出的調(diào)節(jié)月經(jīng)周期節(jié)律的治療方法，即經(jīng)后期以滋陰為主，而經(jīng)前期以補(bǔ)陽(yáng)為主。經(jīng)后期的治療，以當(dāng)歸、山茱萸、干地黃、白芍等滋陰養(yǎng)血藥為主，而經(jīng)前期的治療以巴戟天、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、淫羊藿等補(bǔ)腎助陽(yáng)藥為主。本研究獲得的差異表達(dá)microRNA的靶基因在GO富集的生物學(xué)功能上多集中在生物調(diào)節(jié)、生長(zhǎng)過(guò)程等過(guò)程，在分子功能上多集中在離子的結(jié)合上，在細(xì)胞組成上多富集于細(xì)胞部分、大分子復(fù)合物、細(xì)胞器的合成及代謝等方面。KEGG通路富集分析顯示，光污染大鼠受microRNA調(diào)控的靶基因參與的這些通路中多集中于癌癥、雌激素、MAPK等相關(guān)信號(hào)通路，滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法可能通過(guò)這些相關(guān)信號(hào)通路作用于卵巢組織起到改善卵巢功能的作用。

圖4 實(shí)驗(yàn)組與模型組比較的GO分析圖

前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明[16]，光污染會(huì)引起大鼠情緒障礙，內(nèi)分泌激素紊亂，生殖功能減退。從大鼠卵巢超微結(jié)構(gòu)上看，光污染大鼠卵巢內(nèi)細(xì)胞核染色質(zhì)不均勻，可見(jiàn)較多電子密度較高的異染色質(zhì)，甚至出現(xiàn)邊集現(xiàn)象，高度凝集，核膜形成皺褶，呈現(xiàn)細(xì)胞凋亡樣改變。陳文俊等人[17-18]研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)光照可以抑制褪黑素分泌，升高雌鼠雌二醇、卵泡刺激素及黃體生成素水平，促進(jìn)青春期提前啟動(dòng)，并可通過(guò)干擾褪黑素晝低夜高的節(jié)律變化，導(dǎo)致性腺軸異常，內(nèi)分泌紊亂，動(dòng)情周期失去節(jié)律，動(dòng)情期顯著延長(zhǎng)。持續(xù)光照會(huì)導(dǎo)致大鼠排卵障礙，多發(fā)囊腫、黃體極少。鄒奕潔等人[19]研究表明持續(xù)光照會(huì)引起大鼠被膜增厚，膜間質(zhì)細(xì)胞增生，卵泡發(fā)育停滯，卵泡內(nèi)顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，無(wú)排卵、卵泡原位黃素化并形成大量篩網(wǎng)狀、微囊狀黃體結(jié)構(gòu)，黃體內(nèi)顆粒細(xì)胞顯著減少。光污染引起卵巢大鼠結(jié)構(gòu)的改變是個(gè)復(fù)雜的過(guò)程，涉及到多個(gè)信號(hào)通路，對(duì)任一通路的調(diào)控都可能對(duì)治療光污染引起的生殖功能障礙起到重要作用。本研究中顯著差異表達(dá)的部分microRNA被證實(shí)參與組織細(xì)胞增殖、代謝等過(guò)程。如miR-877被認(rèn)為與腫瘤的發(fā)生發(fā)展呈負(fù)相關(guān)，上調(diào)miR-877可抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和遷移。光污染大鼠卵巢miR-877表達(dá)下調(diào)，推測(cè)可能與細(xì)胞增殖等過(guò)程相關(guān)[20]。盡管尚無(wú)microRNA和光污染關(guān)系的報(bào)道，但是從microRNA調(diào)控一些相關(guān)基因的研究中可間接發(fā)現(xiàn)其與光污染的關(guān)聯(lián)性。

圖5 實(shí)驗(yàn)組與模型組之間的KEGG圖

圖6 對(duì)照組與模型組之間miRNAs相對(duì)表達(dá)水平差異

圖7 實(shí)驗(yàn)組與模型組之間miRNAs相對(duì)表達(dá)水平差異

因此，本研究中篩選到的microRNA可能通過(guò)多種信號(hào)通路影響光污染大鼠卵巢的發(fā)生發(fā)展。高通量測(cè)序技術(shù)的迅速發(fā)展，使得對(duì)一個(gè)物種的基因組和轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行細(xì)致的分析成為可能。本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù)成功篩選到一些與光污染相關(guān)的差異表達(dá)的microRNA，為光污染引起的卵巢發(fā)育以及滋陰補(bǔ)陽(yáng)方序貫法干預(yù)作用的研究提供了新的思路和工作基礎(chǔ)。