陳艷琰，曹玉潔，唐于平，＊＊，陳嘉倩，樂世俊，李佳佳，康 安，周桂生，段金廒

（1.陜西中醫(yī)藥大學 陜西省中醫(yī)藥管理局中藥配伍重點研究室，陜西 西安712046；2.南京中醫(yī)藥大學 江蘇省中藥資源產業(yè)化過程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇省方劑高技術研究重點實驗室，中藥資源產業(yè)化與方劑創(chuàng)新藥物國家地方聯(lián)合工程研究中心，江蘇 南京210023）

大黃-甘草是臨床常用經(jīng)典配伍組合，其配伍應用已有數(shù)千年的歷史。方劑中使用大黃-甘草配伍的例子頗多，如《金匱要略》所載大黃甘草湯（4:1）、《傷寒論》所載調胃承氣湯（2:1）。對中醫(yī)方劑數(shù)據(jù)庫內組成含有大黃-甘草的方劑進行統(tǒng)計，大黃-甘草配伍頻次為2361次，共有93個配伍比例，其中大黃-甘草配比1:1出現(xiàn)頻數(shù)最高，其次為2:1、3:1、1:2、4:1、3:2[1]。對于大黃-甘草配伍的研究主要基于藥物效應、體內代謝、腸道菌群、化學成分等[2-5]，但對其化學成分的研究多集中在甘草對于大黃中化學成分的影響，少有研究大黃對甘草中化學成分變化的影響及系列配伍下的變化規(guī)律。本文以大黃-甘草配伍組合為研究對象，采用超高效液相色譜-三重四級桿質譜串聯(lián)技術（UPLC-TQ/MS），研究在臨床常用不同配比下化學成分相互作用導致的大黃及甘草中主要功效物質變化特點，為揭示大黃-甘草配伍的物質基礎提供科學依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 儀器

Acquity超高效液相色譜儀（美國Waters公司），Xevo TQ質譜儀（美國Waters公司），MassLynxTM質譜工作站軟件（美國Waters公司），超純水機（南京易普易達科技公司），超聲波清洗機（昆山禾創(chuàng)超聲儀器公司），Micofuge 22R Centrifuge型臺式離心機（美國Beckman公司）。

1.2 藥材與試劑

大黃產于甘肅省甘南，甘草產于寧夏靈武市，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學嚴輝教授鑒定，分別為唐古特大黃（Rheum tanguticumMaxim.ex Balf.）的干燥根及根莖，烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensisFisch）的干燥根及根莖。大黃酸等17個標準品購自成都瑞芬思科技有限公司，純度>98%。

2 方法

2.1 供試品溶液制備

大黃、甘草飲片打粉（過40目篩），按照大黃：甘草4:0、4:1、4:2、4:3、4:4、3:4、2:4、1:4、0:4稱取9個配比的樣品。甘草8倍量水先回流提取60 min，后加入8倍量水浸泡30 min的大黃及其浸出液，回流提取5 min，過濾；藥渣再次用8倍、6倍量水提取各5 min，過濾、合并3次濾液[6]。9個配比的濾液各取1mL，分別加甲醇定容至10 mL，0.22μm濾膜過濾，得各供試液，平行制備3份。

2.2 標準品溶液制備

精密稱取各標準品，以90%的甲醇溶解，制成質量濃度為大黃酸15.404μg·mL-1、大黃素15.035μg·mL-1、蘆薈大黃素15.603μg·mL-1、大黃酚12.766μg·mL-1、大黃素甲醚18.440μg·mL-1、大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷19.106μg·mL-1、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖苷14.479μg·mL-1、番瀉苷A 17.872μg·mL-1、番瀉苷B 17.376μg·mL-1、甘草酸19.191μg·mL-1、甘草次酸15.349μg·mL-1、甘草苷14.346μg·mL-1、異甘草苷23.546μg·mL-1、甘草素22.929μg·mL-1、異甘草素25.199μg·mL-1、甘草查耳酮A 15.085μg·mL-1、光甘草定23.005μg·mL-1的混合標準品儲備液。

2.3 色譜條件

Thermo Scientific Hypersil Gold C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9μm），流動相為0.1%甲酸水（A）和乙腈（B），梯度洗脫條件0-1 min，5% B；2-4 min，5%-35% B；4-8 min，35%-95% B；8-13 min，95% B；13-14 min，95%-5%B；14-15 min，5%B；流速0.4 mL·min-1，柱溫35℃，進樣體積2μL。

2.4 質譜條件

ESI離子源，離子源溫度150℃，多反應檢測模式（MRM），毛細管電壓3.0 kV，去溶劑氣溫度150℃，去溶劑氣流量1000 L·h-1，錐孔氣流量30 L·h-1，碰撞氣流量0.15 mL·min-1。各成分保留時間及質譜參數(shù)見表1。

表1 大黃和甘草中17個成分的質譜參數(shù)

2.5 方法學考察

線性關系：取混合標準品儲備液，稀釋成系列混合標準品溶液，依次進樣分析；以各成分的峰面積為縱坐標，質量濃度為橫坐標，繪制標準曲線，計算回歸方程。信噪比為10、3時的標準品濃度分別為定量限（LOQ）、檢測限（LOD）。

精密度：取一份混合標準品溶液，同一天內連續(xù)進樣6次，以及連續(xù)3天內每天重復進樣6次，計算各成分峰面積的相對標準偏差（RSD），考察日內及日間精密度。

重復性：平行制備大黃-甘草1∶1的供試品溶液6份，依次進樣測定，計算各成分峰面積的RSD值，考察儀器的重復性。

穩(wěn)定性：在1、2、4、8、12、24 h時分別進樣大黃-甘草1∶1的供試品溶液，計算各成分峰面積的RSD值，考察樣品的穩(wěn)定性。

加樣回收率：在已知17個成分含量的樣品中加入其含量80%、100%、120%的標準品溶液，進樣測定，計算加樣回收率，加樣回收率=（加標樣品濃度-樣品濃度）/加標量。

3 結果

3.1 色譜及質譜條件優(yōu)化

通過對色譜柱、流動相、梯度洗脫程序、質譜條件等優(yōu)化，獲得大黃和甘草中大黃酸等17個成分的UPLC-TQ-MS圖，見圖1。

3.2 方法學考察

對本文建立的UPLC-TQ-MS進行方法學考察，結果見表2和表3。17種成分線性關系良好，r2均大于0.9984；標準品定量限范圍為0.908 ng·mL-1-57.720 ng·mL-1，檢測限范圍為0.454 ng·mL-1-11.540 ng·mL-1。精密度、重復性、穩(wěn)定性良好，RSD均小于3%；17種成分回收率在98.16%-100.64%范圍內。

3.3 不同配比大黃-甘草中各成分的溶出度變化

對大黃-甘草各配比下大黃酸等17種成分的溶出量測定，計算樣品的進樣濃度，考慮藥材重量、提取液體積、樣品稀釋倍數(shù)等因素，計算各成分的溶出量變化。以甘草酸為例，甘草酸的溶出度=（進樣濃度×樣品稀釋倍數(shù)×提取液體積）/甘草重量。大黃中9種成分的溶出度變化如圖2，甘草中8種成分的溶出量變化如圖3。

4 討論

大黃-甘草多個配比中17個化學成分的溶出結果表明，各成分的溶出存在一定的相互作用且具有一定的規(guī)律性。在大黃：甘草4∶0、4∶1、4∶2、4∶3、4∶4、3∶4、2∶4、1∶4、0∶4這9個配伍比例下，甘草能促進大黃中主要游離蒽醌（大黃酸、大黃素、蘆薈大黃素、大黃素甲醚）、結合蒽醌（大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖、大黃素-8-O-β-D-葡萄糖）及蒽酮（番瀉苷A、番瀉苷B）的溶出；而大黃能促進甘草中主要三萜（甘草酸、甘草次酸）及主要黃酮（異甘草苷）的溶出，抑制部分黃酮（甘草素、異甘草素、甘草查爾酮）的溶出。

大黃中蒽醌及蒽酮類被認為是大黃瀉下的主要成分[6-8]，甘草中的三萜類及黃酮類被認為是甘草發(fā)揮清熱解毒、緩急止痛的主要成分[9]。甘草中的三萜皂苷類成分具有表面活性作用，能促進其他成分的溶出[10]。本研究結果證實甘草能促進大黃中游離蒽醌、結合蒽醌及蒽酮類的溶出，隨甘草比例增加溶出度明顯升高，在大黃-甘草1∶4下尤為顯著；而在大黃-甘草4∶1下，大黃能促進甘草中主要三萜及主要黃酮的溶出。大黃-甘草的化學成分相互作用從物質基礎角度揭示了含大黃-甘草的經(jīng)典名方組方原理。如用于通腑泄熱、和胃止嘔的大黃甘草湯，方中大黃∶甘草為4∶1，此比例下甘草對大黃中蒽醌及蒽酮類物質的溶出影響并不大，大黃酚有所下降、大黃酸有所增加；而大黃對甘草中甘草酸、甘草次酸、異甘草苷的溶出則有顯著的促進作用，此前一直認為兩藥合煎甘草可降低大黃中蒽醌的溶出而緩和其峻猛瀉下作用[11-12]，本研究發(fā)現(xiàn)甘草酸、甘草次酸、異甘草苷的溶出增加可能是甘草調和大黃使其通滯瀉下而不傷正的機理之一。如用于緩下熱結的調胃承氣湯，方中大黃-甘草為2∶1，此比例下甘草對大黃中蒽醌及蒽酮類物質的溶出影響也不大，而大黃對甘草中主要三萜及黃酮的溶出也有顯著的促進作用，即此方中的甘草并不主要發(fā)揮緩瀉作用，而是因為用調胃承氣湯者一般有明顯高熱癥狀，依張仲景用藥經(jīng)驗，大凡有熱必用甘草，取其清熱解毒、緩和病勢之功效[13]。

圖1 UPLC-TQ-MS分析大黃和甘草中17個成分的MRM圖

表2 大黃和甘草中17個成分的線性回歸方程、線性范圍、檢測限和定量限

表3 大黃和甘草中17個成分的精密度、重復性、穩(wěn)定性、回收率測定結果

圖2 大黃中9種成分溶出度變化

圖3 甘草中8種成分溶出度變化

中藥方劑藥效的發(fā)揮與煎煮方法關系甚大，清代醫(yī)學家徐大椿說：“煎藥之法，最宜深講，藥之效不效，全在乎此”?！吨袊幍洹?015版提出大黃用法為“用于瀉下不宜久煎”，在煎煮大黃時主要參照《醫(yī)療機構中藥煎藥室管理規(guī)范》[14]煎藥操作方法“后下藥應當在第一煎藥料即將煎至預定量時，投入同煎5-10 min”。大黃屬于有效成分受熱不穩(wěn)定藥物，其結合蒽醌及蒽酮久煎后多被破壞[15-17]，故在考察大黃-甘草配伍過程中化學成分變化時，采用了大黃后下共煎并提取3次的方法，以保證有效成分的最大溶出而又不至被破壞，從而很好地還原大黃古今用藥規(guī)律。

中藥配伍煎煮過程中由于各類型化學成分間的相互作用可能導致其中化學成分的溶出度變化，從而使效應發(fā)生一定改變，影響臨床用藥的合理性與有效性。甘草配伍應用發(fā)揮的功效與其物質基礎有關，分析含大黃-甘草的2361首方劑，大黃：甘草≥1∶1時，功效頻次為止痛689次、清熱674次、利水552次[1]，此時甘草比例低于大黃，大黃中主要蒽醌及蒽酮的溶出變化并不顯著，而甘草中主要三萜及黃酮的溶出有顯著增加，主要發(fā)揮甘草的止痛、清熱之功及大黃的清熱、利水之效；大黃：甘草<1∶1時，各功效頻次均小于100次，此時甘草比例高于大黃，大黃中主要蒽醌及蒽酮的溶出明顯增加，而甘草中主要三萜及黃酮的溶出變化不明顯，主要發(fā)揮甘草的調和作用。因此，從大黃-甘草合煎過程不同配比化學成分與效應關聯(lián)的角度研究兩藥配伍特征可在一定程度上揭示兩藥組方的規(guī)律，也為中藥組方原理的揭示提供了思路與方法的參考。