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        基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討失笑散治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)的作用機(jī)制研究*

        2019-01-16 11:47:22伍娟娟鄧海婷劉秀芳
        關(guān)鍵詞:數(shù)據(jù)庫

        伍娟娟,何 嘉,鄧海婷,劉秀芳,劉 銳

        (1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院,廣西壯族自治區(qū)南寧市530011;2.廣西中醫(yī)藥大學(xué),廣西壯族自治區(qū)南寧市530001)

        子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis,EM)是指具有活性的子宮內(nèi)膜組織在子宮內(nèi)膜以外部位生長引起的一種疾病,本病最典型的癥狀是繼發(fā)性、進(jìn)行性加劇的痛經(jīng)。EM的病理特征包括種植、侵襲及復(fù)發(fā)率高等[1-2]。中醫(yī)定義為“痛經(jīng)”、“癥瘕”等,病機(jī)主要為瘀血阻滯胞脈、子宮[3-4],治法當(dāng)以活血化瘀為主[5]。在中醫(yī)婦科中講,瘀血內(nèi)阻,氣機(jī)不暢,不通則痛易致痛經(jīng)。中醫(yī)經(jīng)典名方失笑散始載于《太平惠民和劑局方》是由蒲黃、五靈脂所組成,所言“治產(chǎn)后心腹痛欲死,百藥不效,服此頓愈”,其藥甚佳,具有活血化瘀、散結(jié)止痛之功效,主治瘀血內(nèi)停、脈道阻滯、血行不暢所致不通之痛。

        失笑散化學(xué)成分復(fù)雜,已有藥理研究證實(shí)失笑散在不同疾病中具有不同的作用,包括調(diào)節(jié)雌、孕激素水平,抑制異位組織瘢痕增生,抗血管生成和抗炎和改變血液流變學(xué)[6-10]等。同時(shí),失笑散也參與了多個(gè)疾病的病理生理過程[11-13],以上兩個(gè)方面都是其“異病同治”的基礎(chǔ),但其對(duì)異位內(nèi)膜侵襲轉(zhuǎn)移引起疼痛的潛在機(jī)制仍不清晰。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)融合了多向藥理學(xué)和系統(tǒng)生物學(xué)的理念,構(gòu)建失笑散與EM相互作用的藥物與多層次網(wǎng)絡(luò)分析藥效活性成分和可能的分子網(wǎng)絡(luò)機(jī)制,從而建立中藥及其復(fù)方協(xié)同作用聯(lián)系[14-15],旨在為揭示失笑散作用機(jī)制的科學(xué)內(nèi)涵提供參考。

        1 材料與方法

        1.1 失笑散化學(xué)成分信息的收集

        通過TCMSP(http://lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp)收集到失笑散中藥蒲黃的化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選,該數(shù)據(jù)庫共收集了《中華人民共和國藥典》記載的499味中藥材,包含了12144種化學(xué)成分。另外,依據(jù)藥物ADME(吸收、分布、代謝及排泄)特性。選取同時(shí)滿足閾值OB≥30%和DL≥0.18的成分作為潛在的活性成分,同時(shí)通過BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫查找五靈脂的化學(xué)成分進(jìn)行活性篩選,該數(shù)據(jù)庫通過相似產(chǎn)物靶點(diǎn)相近的原理,用留—法互作交叉驗(yàn)證進(jìn)行了預(yù)測的驗(yàn)證,用已驗(yàn)證過的化合物與蛋白的互作作為金標(biāo)準(zhǔn),來對(duì)互作進(jìn)行驗(yàn)證。并通過PubChem(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)以及查閱文獻(xiàn)獲得這些成分的化學(xué)結(jié)構(gòu),并保存為Smiles格式。

        1.2 靶點(diǎn)的選擇

        將篩選得到的潛在活性分子的Smiles結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss Target Prediction(http://www.swisstarget-prediction.ch/)數(shù)據(jù)庫。在靶點(diǎn)預(yù)測中,3D相似性閾值設(shè)置為0.75,2D相似性閾值設(shè)置為0.45,由此獲得與活性成分最相關(guān)的靶點(diǎn)信息。挖掘失笑散中的成分、及對(duì)應(yīng)的潛在靶點(diǎn),并用Cytoscape軟件構(gòu)建成分-潛在靶標(biāo)網(wǎng)絡(luò)。利用Gene Cards(http://www.genecards.org/)和DisGeNET(http://www.disgenet.org/)搜索關(guān)鍵詞子宮內(nèi)膜異位癥(endometriosis)和痛經(jīng)(dysmenorrhea),合并2個(gè)數(shù)據(jù)庫,去除重復(fù)和假陽性的基因,最后與活性成分相關(guān)的靶點(diǎn)相映射,獲得失笑散活性成分的潛在作用靶點(diǎn)。

        1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與關(guān)鍵靶標(biāo)的篩選

        根據(jù)以上預(yù)測結(jié)果,蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)是系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)重要研究內(nèi)容,蛋白相互作用是細(xì)胞、組織的功能的基礎(chǔ),在機(jī)體的生理和病理上起到重要的作用。相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建以String數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)用來分析已知和預(yù)測蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用的數(shù)據(jù)庫。將失笑散活性成分作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫,限定研究物種為人類,獲得蛋白互作關(guān)系,并將該文件中node 1、node 2和Combined score信息導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制蛋白互作網(wǎng)絡(luò),并得到網(wǎng)絡(luò)分析結(jié)果。利用“Network Analyzer”模塊分析PPI網(wǎng)絡(luò)的拓?fù)鋵傩詤?shù),選取度(degree)和介度中心度(betweenness)同時(shí)在平均數(shù)之上的靶標(biāo)為“關(guān)鍵靶標(biāo)”,研究關(guān)鍵靶標(biāo)可能的藥理作用。因其兩個(gè)為主要拓?fù)鋮?shù)。

        1.4 靶點(diǎn)生物功能注釋分析

        DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)是高通量的生物數(shù)據(jù)功能分析挖掘工具,將獲得的失笑散化合物潛在作用靶點(diǎn)導(dǎo)入功能注釋工具,限定研究物種為人類,選擇Gene Ontology下的分子功能(molecular function,MF)、生物過程(biological process,BP)和細(xì)胞組成(cellular component,CC)3個(gè)部分分 析,選 擇Pathway分析中KEGG Pathway,設(shè)定Bonferroni校 正P<0.01,經(jīng)Kappa算法進(jìn)一步尋找活性成分作用靶點(diǎn)顯著富集的主要功能注釋與體內(nèi)通路。

        2 結(jié)果

        2.1 失笑散活性化合物的篩選

        通過數(shù)據(jù)庫檢索及文獻(xiàn)整理,在TCMSP數(shù)據(jù)庫中,通過OB、DL指標(biāo)進(jìn)一步篩選,共收集失笑散的化學(xué)成分15個(gè),其中蒲黃8個(gè),五靈脂7個(gè),見表1。

        2.2 失笑散化合物—靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)

        將潛在活性成分的Smiles格式上傳到Swiss Target Prediction數(shù)據(jù)庫,得到所有成分的預(yù)測靶點(diǎn)225個(gè)。其中,失笑散15個(gè)化學(xué)成分對(duì)應(yīng)225個(gè)潛在靶點(diǎn),五靈脂的潛在作用靶點(diǎn)有105個(gè)、蒲黃120個(gè),利用Cytoscape3.2.1軟件將225個(gè)化合物與靶點(diǎn)。構(gòu)建化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。見圖1,在網(wǎng)絡(luò)中,一個(gè)節(jié)點(diǎn)的表示網(wǎng)絡(luò)中和節(jié)點(diǎn)相連路線的條數(shù)。該網(wǎng)絡(luò)中,每個(gè)化合物的平均靶點(diǎn)數(shù)目為15個(gè),每個(gè)靶點(diǎn)平均與14.2個(gè)化合物相互作用。在靶點(diǎn)中,度值最高的前3位是VEGFA(人血管內(nèi)皮生長因子A)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)。這體現(xiàn)了失笑散多成分與多靶點(diǎn)之間共同作用的機(jī)制,符合中藥復(fù)方的特點(diǎn)。

        2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)與關(guān)鍵靶標(biāo)分析

        將上述作用靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫得到蛋白質(zhì)相互作用關(guān)系,利用Cytoscape軟件繪制蛋白關(guān)系,分別構(gòu)建化合物潛在靶點(diǎn)PPI(158個(gè)節(jié)點(diǎn),620條邊)和子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)靶點(diǎn)PPI(570個(gè)節(jié)點(diǎn),11913條邊),見圖2,靶點(diǎn)以圓形節(jié)點(diǎn)表示,顏色越深、節(jié)點(diǎn)越大表示degree(代表網(wǎng)絡(luò)中具有相互作用的蛋白數(shù)目)越高。將以上兩個(gè)PPI網(wǎng)絡(luò)相交,對(duì)網(wǎng)絡(luò)中所有點(diǎn)的拓?fù)鋮?shù)進(jìn)行分析,選擇靶點(diǎn)中每個(gè)靶點(diǎn)的度拓?fù)鋮?shù)值大于中位數(shù),即度≥16作為篩選核心靶點(diǎn)的條件,介度中心度大于中位數(shù),即1.12×10-2得到41個(gè)核心靶點(diǎn)的失笑散與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。其中涉及的41個(gè)核心靶點(diǎn)見表2。

        表1 失笑散中15個(gè)候選化合物基本信息列表Table 1 Basic information of 15 candidate compounds of Shixiao Powder

        圖1 失笑散主要成分—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

        圖2 網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治?/p>

        2.4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的通路富集分析

        利用DAVID平臺(tái)對(duì)失笑散PPI網(wǎng)絡(luò)中涉及的41個(gè)核心靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析。根據(jù)設(shè)定Bonferroni校正P<0.01,經(jīng)Kappa算法進(jìn)一步確定了41個(gè)GO條目(見表3),其中生物過程主要涉及高分子生物合成過程的正向調(diào)控、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與DNA依賴等方面;分子功能主要涉及生長因子活性、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)活性、轉(zhuǎn)錄因子活性等方面;細(xì)胞組成主要涉及細(xì)胞外組分、細(xì)胞外間隙等方面。表明失笑散的有效成分可能通過作用于這些信號(hào)通路來達(dá)到調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)治療疾病目的。在KEGG數(shù)據(jù)庫中獲得與關(guān)鍵靶點(diǎn)相關(guān)通路82條,結(jié)果表明失笑散可能主要通過癌癥通路(19個(gè)靶點(diǎn))、子宮內(nèi)膜癌(7個(gè)靶點(diǎn))(見圖4)、粘著斑(10個(gè)靶點(diǎn))、絲裂原活化蛋白激酶(11個(gè)靶點(diǎn))、細(xì)胞凋亡(7個(gè)靶點(diǎn))NOD樣受體(10個(gè)靶點(diǎn))、T細(xì)胞受體信號(hào)通路(12個(gè)靶點(diǎn))等信號(hào)通路(見圖3),表明失笑散的活性成分靶點(diǎn)分布于不同的通路,可通過各通路協(xié)調(diào)發(fā)揮作用。

        3 討論

        網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)從整體的角度探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性,強(qiáng)調(diào)從“單靶標(biāo)”向“網(wǎng)絡(luò)靶標(biāo)”研究模式的轉(zhuǎn)變,因此,它與中醫(yī)藥的有機(jī)結(jié)合是一個(gè)富有原創(chuàng)性的研究方向[16]。目前,運(yùn)用多組學(xué)技術(shù)聯(lián)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和生物信息學(xué)的方法來闡釋中藥多組分在分子水平的協(xié)同作用,再結(jié)合整體水平中藥作用機(jī)制的研究,能夠幫助更精確地揭示中藥的藥理學(xué)機(jī)制[17]。

        表2 拓?fù)浞治?1個(gè)核心靶心信息

        表3 失笑散治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)關(guān)鍵靶標(biāo)具有的功能信息

        圖3 KEGG信號(hào)通路分析

        圖4 子宮內(nèi)膜癌信號(hào)通路

        失笑散中蒲黃、五靈脂兩位藥具有活血通絡(luò),化瘀止痛的功效,在婦科臨床疾病的治療中發(fā)揮著重要作用。陳靜麗等[18]臨床發(fā)現(xiàn)通過治療實(shí)性輕、中度痛經(jīng)的臨床療效,經(jīng)前3 d~5 d至經(jīng)凈給予治療有效率達(dá)到96.67%。王妍等[19]通過120例觀察治療前后痛經(jīng)程度及持續(xù)時(shí)間的變化,發(fā)現(xiàn)治療子宮腺肌病痛經(jīng)療效確切。在實(shí)驗(yàn)研究表明[20]失笑散能夠明顯增強(qiáng)離體子宮的收縮頻率,降低全血比黏度,抗血栓形成及鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛等作用。劉文粢等發(fā)現(xiàn)[21]失笑散中的Fe、Zn、Mn、Cu、Ni等微量元素具有活血的作用,其中Fe和Cu活血化瘀的作用較大。目前,現(xiàn)代藥理研究認(rèn)為蒲黃、五靈脂具有改善子宮微循環(huán),鎮(zhèn)痛,降低毛細(xì)血管通透性,減少滲出,影響異位增生的子宮內(nèi)膜的局部代謝,促使異位內(nèi)膜退化脫落等作用。本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)其治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)的作用機(jī)制做進(jìn)一步深入研究。

        本研究系統(tǒng)分析了蒲黃、五靈脂兩位中藥的有效成分,分析化合物與靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。其中化合物—靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中關(guān)鍵藥物是山奈酚、槲皮素等,其是蒲黃中的有效成分。根據(jù)研究顯示[22],槲皮素具有同步抑制卵巢癌細(xì)胞生存能力和免疫抑制因子VEGF表達(dá),并且可以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,這其中的機(jī)制與Wnt/βcatenin信號(hào)通路下調(diào)有關(guān)。在抗腫瘤方面[23],通過抑制Eca109細(xì)胞的遷移、侵襲及血管新生;可抑制細(xì)胞增殖,調(diào)控細(xì)胞的附著和侵襲的作用。抑制體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(EVC304)生長[24];還有減少毛細(xì)血管脆性、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈和增加冠脈血流量等作用。山柰酚是一種具有抗炎并且抗氧化作用的黃酮類化合物;周瑤等[25]研究發(fā)現(xiàn)其抗腫瘤作用明顯,高劑量會(huì)降低晚期大腸腺瘤的復(fù)發(fā),并從體外發(fā)現(xiàn)其對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16具有增殖抑制作用;還能通過抑制銅離子誘導(dǎo)成為氧化低密度脂蛋白,阻止對(duì)氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)的攝取,有效預(yù)防動(dòng)脈粥樣硬化。五靈脂酸[26-27]在體外有明顯的抑制血小板聚集活性,并顯示了不同程度的抗菌活性。

        在化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)中,部分關(guān)鍵化合物分子具有高度的中心性并且應(yīng)用于婦科領(lǐng)域的研究,雌激素受體(ESR1)、VEGFA(人血管內(nèi)皮生長因子A)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP-9)和細(xì)胞間粘附分子-1(ICAM-1)等為關(guān)鍵靶點(diǎn)。VEGFA主要作用是增加小靜脈血管與微血管的通透性,因此稱為血管通透因子,也稱促血管素。臨床研究發(fā)現(xiàn),VEGFA在子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹膜液中一直被高濃度檢測到,其水平似乎與疾病分期有關(guān)[28]。VEGFA在腹膜內(nèi)植入物的腺體區(qū)室中大量表達(dá),在子宮內(nèi)膜瘤中,并且由活化的腹膜巨噬細(xì)胞分泌[29-30]。并且它的的表達(dá)表現(xiàn)出與卵巢類固醇調(diào)節(jié)一致的循環(huán)相依賴性。MMP和它們的抑制劑(TIMP)參與細(xì)胞外基質(zhì)重塑和環(huán)狀子宮內(nèi)膜周轉(zhuǎn)和月經(jīng)[31-32]。MMP的月經(jīng)周期階段特異性表達(dá)提示卵巢類固醇調(diào)節(jié)。MMP和TIMP之間的平衡對(duì)于維持適當(dāng)?shù)腗MP活性水平至關(guān)重要,并且不能維持這種平衡可能導(dǎo)致基質(zhì)分解和細(xì)胞侵襲。ICAM-1通過從子宮內(nèi)膜異位癥的潛在機(jī)制子宮內(nèi)膜間質(zhì)細(xì)胞的組成通過脫落這些細(xì)胞逃避自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)的清除[33-34]。受損的NK細(xì)胞功能可賦予回流的子宮內(nèi)膜細(xì)胞免疫特權(quán)狀態(tài),從而易患疾病。子宮內(nèi)膜異位癥患者的巨噬細(xì)胞功能受損可能進(jìn)一步導(dǎo)致這種細(xì)胞類型的病變清除率降低。MAPK1和MAPK3為主要核心靶點(diǎn),都同屬于MAPK激酶家族,是由多種磷酸基團(tuán)蛋白構(gòu)成,可觸發(fā)一系列的下游信號(hào)反應(yīng),如參與基因表達(dá)、細(xì)胞存活和凋亡等多種生理過程。而且MAPK途徑的作用與癌癥、自身免疫性疾病等多種疾病相關(guān)[35]。Li等[36]研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜異位癥患者與對(duì)照組的基因差異表達(dá)譜中,細(xì)胞增殖誘導(dǎo)異位,說明在子宮內(nèi)膜異位癥中同樣涉及到MAPK信號(hào)通路。加壓素(AVP)作為核心靶點(diǎn),也是五靈脂化合物Urea的靶點(diǎn),研究發(fā)現(xiàn)AVP與子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)密切相關(guān),相對(duì)于粗大的血管,子宮肌層小血管對(duì)血管AVP的敏感性更大。Williams等[37]研究證實(shí)血管加壓素是一種比催產(chǎn)素更強(qiáng)烈的子宮收縮劑,對(duì)非孕子宮有較強(qiáng)的刺激作用,尤其在孕激素效應(yīng)與雌激素受體(ESR1)存在時(shí)作用明顯。

        對(duì)失笑散的靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建網(wǎng)絡(luò),對(duì)網(wǎng)絡(luò)分析后發(fā)現(xiàn)了多個(gè)與多種復(fù)雜疾病緊密相關(guān)的關(guān)鍵靶點(diǎn),如TP53、IGF1、TNF、PIK3CA、CYP1A1、IL6、FOS、IL8、MAPK1、MAPK3、ESR1、PTGS2、EGFR等,本病多見瘀血內(nèi)阻,氣機(jī)不暢病機(jī),治法常以活血化瘀為主,與活血化瘀功效相關(guān)的靶點(diǎn)包括ICAM1、MMP-9、TIMP-1和VEGFA[38-39]。為了說明作用靶點(diǎn)在基因功能和信號(hào)通路中的作用,本研究進(jìn)行了GO功能富集和KEGG通路富集分析。發(fā)現(xiàn)失笑散主要能夠調(diào)節(jié)高分子生物合成過程的正向調(diào)控、生物合成過程的正向調(diào)節(jié)、高分子代謝過程的正向調(diào)節(jié)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)與DNA依賴等方面功能。大多數(shù)的基因富集到了與癌癥有直接關(guān)系的通路上,包括癌癥通路、子宮內(nèi)膜癌通路、胰腺癌通路等;另一大部分主要調(diào)控信號(hào)通路,包括MAPK信號(hào)通路、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡等。Yotova等研究表明[40]MAPK信號(hào)傳導(dǎo)通路作為交匯點(diǎn)和關(guān)鍵通路,可被多種細(xì)胞外刺激通路激活進(jìn)而參與胞內(nèi)信息的傳遞途徑。Wu等實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)雌激素能激活MAPK信號(hào)通路,子宮內(nèi)膜異位癥病灶中存在MAPK的高表達(dá),給予鞘內(nèi)注射抑制劑后可使子宮內(nèi)膜異位癥病灶縮小、神經(jīng)纖維分布以及疼痛消失[41]。已有研究顯示[42],失笑散通過降低丙二醇含量和提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽-過氧化物酶活性,調(diào)控氧化損傷機(jī)制保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞的有效提取物。另外,根據(jù)分析結(jié)果推斷失笑散中的活性成分可能通過作用于與癌癥直接相關(guān)的通路,從而對(duì)多種癌癥起到治療作用。失效散治療腫瘤和心血管病的機(jī)理,可能也存在于治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)中,因?yàn)樽訉m內(nèi)膜異位癥是具有種植、浸潤、廣泛轉(zhuǎn)移等惡性腫瘤特性的良性疾病,目前相關(guān)機(jī)制研究稀少,借此分析希望能進(jìn)行初步探討。

        綜上所述,本研究初步探究了失笑散多成分、靶點(diǎn)和通路的多因素機(jī)制過程,為后續(xù)從失笑散中提取有效藥物成分治療子宮內(nèi)膜異位癥痛經(jīng)提供了前提和依據(jù)。

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