劉艷飛，孫明月，姚賀之，柴露露，高 蕊＊＊

（1.北京中醫(yī)藥大學研究生院 北京100029；2.中國中醫(yī)科學院西苑醫(yī)院臨床藥理研究所 北京100091）

代謝綜合征（Metabolic Syndrome，MS）是以肥胖（或超重）、高血糖、高血壓、血脂代謝異常等為主要特征的一組臨床綜合征[1]。近年來我國MS的發(fā)病率明顯增高，數(shù)據(jù)顯示我國18歲以上的成人中MS的患病率約為33.9%，據(jù)此估計中國目前有4.5億MS患者[2]。MS嚴重威脅著人類的健康，其心血管事件的發(fā)病及死亡危險約為非MS患者的2-3倍[3]。現(xiàn)代醫(yī)學采取單一疾病的治療模式對MS的各個組分進行不同方式的干預，尚缺乏整體干預方案。中醫(yī)藥治療MS具有很大的優(yōu)勢，前期課題組采用文獻計量學的研究方法，對治療代謝綜合征的中藥使用頻次進行統(tǒng)計，選取頻次居于前10的高頻中藥行進一步的研究，十味高頻中藥分別為黃芪、茯苓、丹參、澤瀉、山楂、半夏、大黃、白術、黃連、川芎[4]。本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法探索高頻中藥治療MS的主要活性成分、核心靶點及其作用機制，為中醫(yī)藥治療MS提供一定的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 MS相關疾病靶點、基因的查詢

以"Metabolic Syndrome"為關鍵詞檢索TTD（http://bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）、DrugBank（https://www.drugbank.ca/）、Pharmgkb（https://www.pharmgkb.org/）、CTD（http://ctdbase.org/）等數(shù)據(jù)庫，去重后獲得疾病的相關靶點。通過Uniprot（https://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫查詢靶點蛋白的基因名稱。

1.2 高頻中藥活性成分的篩選和靶點預測

本研究以治療MS的高頻中藥黃芪、茯苓、丹參、澤瀉、山楂、半夏、大黃、白術、黃連、川芎為關鍵詞，分別檢索TCMSP數(shù)據(jù)庫（http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）[5]，以OB≥30%，DL≥0.18為篩選條件，對其成分及作用靶點進行篩選構建。

1.3 MS靶點-高頻中藥成分相關網(wǎng)絡的構建

將MS相關疾病靶點與中藥成分作用靶點用UniProt數(shù)據(jù)庫中的Gene name進行標準化命名。將高頻中藥成分、高頻中藥成分作用的疾病靶點與MS的疾病靶點運用Excel表格建立數(shù)據(jù)庫并進行整合，獲得高頻中藥成分作用于MS的靶點。采用Cytoscape軟件構建MS靶點-高頻中藥成分網(wǎng)絡，并進行可視化分析等。采用Cytoscape軟件中的CytoNCA插件導出MS靶點-高頻中藥活性成分網(wǎng)絡的拓撲數(shù)據(jù)，計算數(shù)據(jù)中網(wǎng)絡節(jié)點度（degree）和介數(shù)（betweenness）的中位數(shù)。網(wǎng)絡節(jié)點度（degree）和介數(shù)（betweenness）是網(wǎng)絡藥理分析中的重要參數(shù)，定義大于等于degree值中位數(shù)的2倍且具有較高介數(shù)（大于等于介數(shù)值的中位數(shù)）的靶點為核心靶點[6]。得到MS核心靶點后，進一步構建中藥治療MS核心靶點-高頻中藥成分網(wǎng)絡，根據(jù)核心靶點進行中藥治療MS主要活性成分的篩選。

1.4 富集通路分析

通過DAVID數(shù)據(jù)庫行KEGG通路富集，Bonferroni法校正后P<0.05的通路被認為是顯著富集。

2 結果

2.1 MS疾病靶點篩選

檢索TTD、DrugBank、Pharmgkb、CTD數(shù)據(jù)庫獲得161個MS的疾病靶點，結果見表1。

2.2 高頻中藥的活性成分及其作用疾病靶點預測

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索到十味高頻中藥已報道的成分732個，以OB≥30%和DL≥0.18作為條件，經(jīng)篩選后共得到活性成分黃芪20個、茯苓15個、丹參65個、澤瀉10個、山楂6個、半夏13個、大黃16個、白術7個、黃連10個、川芎7個，同時在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索中藥成分作用的疾病靶蛋白，將中藥活性成分作用的疾病靶點與MS的疾病靶點進行整合，獲得中藥成分作用于MS靶點的608條結果。十味高頻中藥成分作用于MS的靶點基因的部分結果見表2。

2.3 MS靶點-高頻中藥成分相關網(wǎng)絡的構建

利用Cytoscape軟件建立“MS靶點—中藥成分網(wǎng)絡”，詳見圖1，該網(wǎng)絡有155個節(jié)點，612種相互作用關系。通過網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)高頻中藥成分可作用于24個MS靶點，利用cytoscape3.6.0軟件分析計算MS靶點—中藥成分網(wǎng)絡的度（degree）值和介數(shù)，截取24個MS靶點的degree值中位數(shù)兩倍及其以上的節(jié)點（degree≥10）且具有較高介數(shù)（介數(shù)值≥8.47）的靶點為核心網(wǎng)絡靶點，分析獲得了7個中醫(yī)治療MS的核心靶點，具體結果見表3，推測這7個靶點可能與高頻中藥治療MS的作用機制相關。

根據(jù)核心網(wǎng)絡的篩選，發(fā)現(xiàn)有137個中藥成分可以作用于7個MS核心靶點，為了進一步分析網(wǎng)絡中主要的活性成分，針對137個成分及7個核心靶點構建“中藥治療MS核心靶點-中藥成分網(wǎng)絡”（圖2），網(wǎng)絡分析發(fā)現(xiàn)有26個成分可以作用于4個及以上的靶點，且具有較高的介數(shù)（介數(shù)值≥4），分析網(wǎng)絡提示這些主要活性成分的變化可能對MS靶點-中藥成分網(wǎng)絡的穩(wěn)定性會產(chǎn)生較大的影響，從而改變中藥治療MS的療效，推測這26個中藥成分為高頻中藥組治療MS的主要活性成分，具體中藥成分見表4。進一步分析26個中藥活性成分中含有較多的黃酮類化合物（山奈酚、槲皮素、兒茶素、異鼠李素等）、醌類化合物（主要分為丹參酮；丹參內(nèi)脂類，如四氫丹參酮、亞甲基丹參醌、二氫丹參內(nèi)脂、新隱丹參酮II等）。

將24個中藥成分作用于MS的基因?qū)隓AVID數(shù)據(jù)庫進行通路富集分析，排除寬泛的通路，選取Bonferroni法校正后P<0.05的通路，具體KEGG通路如表5所示。

3 討論

代謝綜合征是以肥胖（或超重）、高血糖、高血壓、血脂代謝異常等為主要特征的一組臨床綜合征[1]，本研究運用網(wǎng)絡藥理學方法對中藥治療代謝綜合征的作用機制進行了初步的探討。研究發(fā)現(xiàn)高頻中藥的主要活性成分黃酮類和醌類化合物可能作用于AR、PTGS2、PTGS1、ESR2、ADRB2、eNOS、PPARG等7個核心靶點，通過調(diào)控上游通路胰島素抵抗通路，下游信號通路PPAR信號通路、雌激素信號通路、TNF信號通路等達到治療代謝綜合征的作用。

表1 代謝綜合征疾病靶點

7 個信號通路中最多的作用為調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝。脂肪組織是機體內(nèi)重要的儲能器官，也為其他組織或器官提供能量[7],脂肪細胞的脂解過程是一個復雜的過程，由脂肪組織脂解產(chǎn)生的活性物質(zhì)與代謝性疾病如胰島素抵抗、糖尿病、脂肪肝、高血壓、心血管疾病密切相關[8,9]。

圖1 MS靶點—中藥成分網(wǎng)絡

表2 高頻中藥成分作用于MS的疾病靶點、基因的結果（部分）

核心靶點中PPARG、ESR能夠參與脂質(zhì)的代謝[10-14]。本研究中高頻中藥活性成分可作用于過氧化物酶γ受體（PPARG）、雌激素受體（ESR）等靶點，這一作用主要通過PPAR信號通路、雌激素信號通路、花生四烯酸信號通路實現(xiàn)。過氧化物酶增殖體激活受體γ的基因多態(tài)性與糖脂代謝有著一定的關系。唐新等[10]通過測定糖尿病患者與正常健康者PPARG基因的多態(tài)性發(fā)現(xiàn)PPARG基因可能參與糖尿病患者的糖脂代謝。研究顯示PPAR與相關的配體結合激活轉(zhuǎn)錄因子，通過調(diào)控靶基因而調(diào)節(jié)機體的脂肪、能量的代謝[11,12]。高倩等[13]研究發(fā)現(xiàn)，PPAR配敲除的ob/ob小鼠肥胖和脂肪肝明顯加重。Monjo等[14]研究表明雌激素受體介導，可影響脂肪分布的部位，通過上調(diào)不同受體的表達，促進脂肪的分解。雌激素信號通路通過細胞膜上的雌激素受體進行信號轉(zhuǎn)導，通過調(diào)節(jié)下丘腦神經(jīng)肽的水平達到調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、影響能量代謝，同時可促進瘦素及其脂肪酸結合蛋白的分泌，促進脂肪的分解[15]?；ㄉ南┧崾求w內(nèi)分布最為廣泛的多不飽和脂肪酸之一,對于維持細胞膜的結構和功能有著重要的作用[16,17]，文獻表明花生四烯酸對胰島素抵抗及肝糖原輸出紊亂具有預防作用[18],可抑制前體脂肪細胞向成熟脂肪細胞轉(zhuǎn)化、減少脂肪生成量[19]。因此，高頻中藥可能通過PPAR信號通路、雌激素信號通路、花生四烯酸信號通路、脂肪細胞的脂解作用達到調(diào)節(jié)脂肪代謝，治療代謝綜合征中血脂異常這一組分。

表3 高頻中藥成分治療MS的核心靶點

圖2 中藥治療MS核心靶點-中藥成分網(wǎng)絡

已知eNOS、ADRB2是調(diào)節(jié)血管舒縮功能的介質(zhì)[20-25]，PTGS1、PTGS2具有抗血管收縮介質(zhì)的作用[28,29]。內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）可參與血壓的調(diào)節(jié)，有研究表明內(nèi)皮一氧化氮合酶位點基因突變與高血壓的發(fā)生有一定的關系[20]，內(nèi)皮一氧化氮合酶的含量與血清脂聯(lián)素、一氧化氮聯(lián)合作用影響著高血壓、糖尿病患者的血壓、血糖水平[21-23]。研究發(fā)現(xiàn)當阻斷大鼠腦內(nèi)eNOS的活性時，大鼠的平均動脈壓會升高，在高血壓發(fā)病前期，大鼠腦內(nèi)的eNOS的活性降低，參與了高血壓的生成，在形成穩(wěn)定性高血壓時，eNOS的活性會出現(xiàn)升高以代償性地降低血壓，因此，eNOS在血壓變化的過程中起著重要的作用[24]。β2腎上腺素能受體是交感神經(jīng)的重要組成之一，若其功能障礙，可導致高血壓（主要為原發(fā)性高血壓）的發(fā)生，當β2上腎上腺素能受體功能的基因表型（如Arg16Gly、Thr164Ile、Gln27Glu等）發(fā)生改變時，患者的血壓會發(fā)生明顯的變化[25-27]。前列腺素G/H合酶（PTGS）內(nèi)皮源性血管舒張因子可以前列環(huán)素受體G蛋白耦聯(lián)受體結合，激活G蛋白，引起細胞內(nèi)cAMP水平升高，cAMP激活蛋白激酶A，引起血小板聚集性抑制，血管平滑肌松弛因此前列環(huán)素及其類似物可產(chǎn)生對抗血管收縮介質(zhì)的作用，引起血壓的降低[28,29]。因此，高頻中藥可能作用于eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2參與調(diào)節(jié)代謝綜合征患者的血壓水平。

表4 高頻中藥治療MS的主要活性成分

表5 KEGG通路富集結果

此外，肥胖、糖尿病、高脂血癥、高血壓等與代謝相關的疾病逐年增多，而胰島素抵抗是上述疾病共同的危險因素及病理基礎，胰島素信號通路任何一位點的異常都可導致胰島素抵抗[30]。肥胖是發(fā)生在脂肪組織中的炎癥狀態(tài)，肥胖引起的胰島素抵抗可能與炎性細胞因子（如TNF-α）的表達增加有關[31]，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α處理脂肪細胞表現(xiàn)出胰島素信號和糖攝取降低，TNF-α-/-小鼠高脂飲食誘導肥胖后與對照組相比，血糖和胰島素水平明顯降低，葡萄糖和胰島素敏感性得到改善[32]。雄激素受體介導雄激素發(fā)揮作用，雄激素的水平與肥胖、糖脂代謝相關。雄激素受體介導雄激素發(fā)揮作用，雄激素水平過高的女性，如多囊卵巢綜合征患者，可出現(xiàn)肥胖、糖脂代謝紊亂、胰島素抵抗以及糖尿病等肥胖相關疾病[33,34]。本研究發(fā)現(xiàn)高頻中藥可以作用于雄激素及胰島素抵抗信號通路達到減輕代謝綜合征患者肥胖及胰島素抵抗的問題。

26 個中藥活性成分中含有較多的黃酮類化合物（山奈酚、槲皮素、兒茶素等）、醌類化合物（丹參酮、丹參內(nèi)脂類等）。文獻研究顯示，黃酮類化合物如兒茶素、槲皮素等均對動物實驗性脂質(zhì)代謝異常、動脈粥樣硬化具有較好的防治作用[35-37]。于春剛等[38]建立鵪鶉高脂食餌性動脈粥樣硬化模型后，將其隨機分為空白對照組、洛伐他汀組（79.5 mg·kg-1）及兒茶素低劑量組（20 mg·kg-1）、中劑量組（40 mg·kg-1）、高劑量組（80 mg·kg-1），結果顯示與模型組相比,兒茶素中劑量組血清高密度脂蛋白膽固醇含量明顯升高，各劑量組肝臟脂肪變分級明顯低于模型組，研究表明兒茶素具有調(diào)節(jié)血脂和預防動脈粥樣硬化的作用。呂麗等[39]將動脈粥樣硬化模型大鼠分為空白對照組、辛伐他汀組（4 mg/kg/d）、槲皮素高劑量組（50 mg/kg/d）及低劑量組（25 mg/kg/d），實驗結果表明槲皮素可降低動脈粥樣硬化大鼠血脂甘油三酯及總膽固醇水平，實現(xiàn)其抗動脈粥樣硬化的作用，其作用機制可能與激活PI3K/Akt/NF-κb通路有關。醌類化合物如丹參酮聯(lián)合西藥可明顯降低高血壓患者的血壓和血脂水平[40,41]。楊文聰?shù)萚40]將80例原發(fā)性高血壓患者隨機分為卡托普利對照組，丹參酮ⅡA聯(lián)合卡托普利的治療組，予以藥物治療8周后結果顯示兩組的血壓均有下降；與對照組相比，治療組患者的血壓水平明顯降低，血管內(nèi)皮一氧化氮含量明顯增加、內(nèi)皮素-1含量明顯降低，結果提示丹參酮ⅡA聯(lián)合卡托普利可以顯著降低原發(fā)性高血壓患者的血壓水平，其作用機制可能與調(diào)控血管內(nèi)皮功能有關。以上提示黃酮類化合物和醌類化合物具有抗代謝綜合征危險組分的作用，其可能是治療MS的重要成分群組，在后續(xù)藥效物質(zhì)基礎及分子機制的研究中可加以關注。

高頻中藥治療代謝綜合征呈現(xiàn)出多成分、多靶點、多通路的作用特點，其主要活性成分可通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝（如PPARG、ESR等）、調(diào)節(jié)血壓水平（如eNOS、ADRB2、PTGS1、PTGS2等）、減輕胰島素抵抗等作用參與對代謝綜合征不同危險因素的調(diào)控，進而影響代謝綜合征的發(fā)展。本研究為后續(xù)系統(tǒng)開展中藥治療代謝綜合征的藥效物質(zhì)基礎及分子作用機制提供了一定的理論依據(jù)。