徐聯(lián)調(diào)，李文佳，陳 茵，李筱琪，楊青青，吳顥昕，陳 剛，周 欣＊＊

（1.南京中醫(yī)藥大學 中醫(yī)腦病研究實驗室 南京210023；2.暨南大學 腦病個體化醫(yī)學跨學科研究所 方證研究中心 廣州510632）

抑郁癥為復雜的心境障礙疾病[1]，對個人、社會乃至國家造成巨大的負擔[2]。約有30%患者對經(jīng)典抗抑郁藥的治療沒有反應[3]，而投放市場的新藥與之前的藥物相比，對癥狀的改善未達到預期的效果，對副作用的改善也不理想[4]。抑郁癥的病因尚不確定，通常認為神經(jīng)、遺傳、社會等多種因素導致了抑郁癥的發(fā)生[5]。據(jù)流行病學調(diào)查結果顯示，有家族抑郁癥史的人患抑郁癥的幾率高[6]。遺傳對動物的應激易感性及抗抑郁作用也有顯著影響，例如，Balb/cJ與C57BL/6J小鼠在慢性不可預知應激造模情況下，Balb/cJ小鼠更易表現(xiàn)出抑郁樣癥狀[7]。相較于ICR小鼠，越鞠丸在昆明小鼠上表現(xiàn)出更持久的抗抑郁作用[8]。

對于抑郁癥，中醫(yī)辨證論治實施個體化治療。楊煥新[9]對250例抑郁癥患者進行中醫(yī)體質分類發(fā)現(xiàn)，抑郁癥患者體質主要集中為氣郁質占24.8%、氣虛質占16.67%，揭示抑郁癥與中醫(yī)體質存在關聯(lián)性。體質以及相關的證候易感性很大程度上由先天稟賦的遺傳物質決定。我們提出抑郁癥和各種證候對環(huán)境應激反應的差異性，導致了病證表現(xiàn)的差異性，這可以通過抑郁癥與特定證候對應激的共易感性予以揭示出來[10]。

前期我們對Balb/c和129/S1兩品系小鼠，進行慢性不可預知應激和皮質酮皮下注射分別造模,兩個品系小鼠均表現(xiàn)為抑郁樣證候，但是Balb/c品系小鼠還出現(xiàn)顯著而穩(wěn)定的氣虛樣證候[11]，提示Balb/c品系小鼠為抑郁癥氣虛證共易感小鼠，支持遺傳因素參與決定疾病與證候差異性。本研究采用慢性不可預知應激與社交挫敗應激對Balb/c和129/S1兩品系小鼠造模，以確定Balb/c小鼠抑郁癥氣虛證候共易感性的穩(wěn)定性。并比較理氣方藥越鞠丸治療兩個品系抗抑郁和改善證候的差異性，檢測其作用與PKA-CREB通路蛋白的相關性。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

健康雄性Balb/c和129/S1小鼠購于上海斯萊克實驗動物有限責任公司（許可證號：SCXK（滬）2017-0004），飼養(yǎng)在SPF級動物屏障房內(nèi)，6只一籠，糧水攝入自由，室溫25±2℃，相對濕度為50%～60%。正常喂養(yǎng)1周后用于實驗。

1.2 藥物與試劑

越鞠丸（Yueju pill，YJ）購自胡慶余堂（批號：Z33020041），粉碎成末，用0.9%生理鹽水溶解配成0.2 g/ml的藥液。上述藥液分裝在10 mL離心管內(nèi)，-20℃保存。鹽酸氟西?。‵luoxetine，F(xiàn)LX）購于美國Sigma-Aldrich公司。主要試劑：CREB（Cell Signaling Technology，#9197，1:1000）；p-CREB（Cell Signaling Technology，#9198，1:500）；PKA（Cell Signaling Technology，#4782,1:1000）；β-tubulin（Epitomics，1879-1，1:2000），均為兔抗，二抗羊抗兔HRP（正能，511203）。

1.3 儀器

主要儀器：自發(fā)活動、強迫游泳、懸尾測試視頻分析系統(tǒng)（上海吉量軟件公司）；拉力計（浙江樂清艾德堡儀器有限公司）；體視顯微鏡（蘇州銀瑞計量儀器有限公司）；電泳儀（美國Bio-Rad公司）；全自動發(fā)光顯影儀Tannon-5200（上海天能科技有限公司）。

1.4 造模方法

1.4.1 社交挫敗抑郁模型（Social defeat）

造模方法在Golden的基礎上略加修改[12]。將實驗小鼠放入飼養(yǎng)籠內(nèi)適應3 min后，再放入體型較大及好斗的陌生小鼠，觀察到實驗小鼠被擊敗3-4次后（每次造模時間10 min左右，小鼠被擊敗表現(xiàn)為打翻在地或發(fā)出驚叫，實驗過程保證實驗小鼠不被打傷），將兩鼠分開放于同一籠內(nèi)飼養(yǎng)（飼養(yǎng)籠用透明板隔開，陌生鼠與實驗小鼠置于隔板于兩邊，使其看到接觸不到,但實驗小鼠接受陌生小鼠聲音及嗅覺的刺激）24小時后，重復以上步驟。刺激同一實驗小鼠的陌生鼠不相同。連續(xù)刺激21天后，然后進行其他抑郁行為與證候檢測，對照組正常飼養(yǎng)。

1.4.2 慢性不可預知溫和應激抑郁模型（CUMS）

慢性不可預知溫和應激操作如下：將Balb/c、129/S1兩品系小鼠隨機分組。模型組小鼠單籠飼養(yǎng)并每日隨機給予一種刺激（濕籠、空籠、45°斜籠、24 h禁水、禁食24 h、帶孔50 ml管內(nèi)束縛6 h、兩次徹夜光照12 h，連續(xù)刺激4周。

1.5 給藥及分組

慢性不可應激抑郁造模成功后，模型組隨機分為3組：模型對照組和空白組均以0.9%生理鹽水灌胃，越鞠丸組以越鞠丸0.1 ml/10 g灌胃，氟西汀組以氟西汀注射液0.1 ml/10 g腹腔注射。給藥一周結束后進行行為學檢測。

1.6 行為學測試

1.6.1 糖水偏好檢驗（SPT）

造模前，給予實驗小鼠質量分數(shù)為2%的蔗糖溶液進行適應三天。造模結束后，小鼠禁水16～18 h后單只置于新籠內(nèi)。每只小鼠被給予稱重過的糖和水各一瓶，1 h后交換放置糖水與純凈水的位置，2 h回收并記錄瓶子的重量，計算小鼠糖水攝入占總攝入液體的比值為其糖水偏好度。

1.6.2 懸尾測試（TST）

輕提起小鼠，將小鼠尾部大約1 cm處用膠布固定在測試箱鉤子上，保持環(huán)境安靜，使用懸尾測試系統(tǒng)記錄小鼠在倒掛6 min內(nèi)的活動，使用軟件采集小鼠在后4 min內(nèi)累計不動時間。

1.6.3 強迫游泳測試（FST）

將小鼠投入灌水的玻璃缸中，水溫在23～25℃，測試在安靜環(huán)境中進行，使用測試系統(tǒng)記錄小鼠在缸中6 min的游泳情況,并采集后4 min內(nèi)小鼠漂浮于水面上放棄掙扎時間。

1.6.4 新奇環(huán)境攝食抑制測試（NSF）

小鼠禁食禁水16～18小時，小鼠在中央放置稱量好食物的籠內(nèi)自由探索與攝食10 min。小鼠放入籠子起至其初次啃食食物的時間為進食潛伏時間，記錄稱重每只小鼠10 min內(nèi)的食物總消耗量。

1.6.5 抓力測試（Grip Strength）

左手將拉力計上的掛鉤勾在網(wǎng)格上，右手拉住鼠尾使小鼠在網(wǎng)格上均勻拖行，在拉力計上讀出該小鼠的最大抓力，3次重復測試值算得平均值為該小鼠的抓力。

1.6.6 前爪掌紋血色比值測試（Degree of Redness）

在方肇勤的方法[13]基礎上，輕輕抓取小鼠并將右前爪置于體視顯微鏡拍攝，使用Photoshop軟件抓取前爪第二三掌趾肉墊間脈絡血色的R、G、B值，以R/(R+G+B)的比值作為前爪掌紋脈絡血色度評價指標。

1.6.7 負重游泳測試（Exhausted Swim Test）

小鼠尾部的1～3 cm處施加小鼠體重的12%重量后，記錄從小鼠被放入水中至沉入水中8 s的時間為小鼠沉沒潛伏期。由于此測試中情感性影響較大，在氣虛評判中，可作為次要指標。

1.7 蛋白免疫印跡法（WB）

實驗小鼠脫椎處死后立即取腦部海馬組織并剝離肌肉組織，低溫下研碎樣品提取蛋白并測定濃度。凝膠電泳分離蛋白質并轉至PVDF膜上。麗春紅顯色后切得目的條帶，清水洗10分鐘并無麗春紅殘留后于3%BSA封閉1 h，洗去封閉液后在目的條帶并加入相應抗體，4℃過夜。分別回收抗體后TBST重復洗3次，洗滌完畢放入二抗室溫靜置1 h?；厥斩共⒅貜鸵陨锨逑床襟E，最后用濾紙吸去條帶多余液體，置于ECL發(fā)光底物中顯色，顯影并采集條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計學方法

用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，多組間數(shù)據(jù)采用單因素方差法，兩品系小鼠空白對照組和模型組數(shù)據(jù)采用雙因素方差法，數(shù)據(jù)以mean±sem表示，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

圖1 造模后Balb/c與129/S1兩品系小鼠的抑郁樣行為（ABC為社交挫敗造模后行為；DEF為慢性不可預知應激造模后行為）

2 結果

2.1 社交挫敗應激造模與慢性不可應激造模結束后，Balb/c和129/S1兩品系小鼠均表現(xiàn)為抑郁樣證候

21 天社交挫敗造模結束后，兩品系小鼠均出現(xiàn)社會交互時間顯著下降（p<0.01圖1A），糖水偏好度下降（p<0.05，p<0.01圖1B），攝食潛伏期顯著延長（p<0.01，p<0.05圖1C）。與正常組相比，Balb/c和129/S1模型組小鼠體重顯著減輕（p<0.001圖1D），糖水偏好度顯著下降（p<0.001圖1E），在強迫游泳測試中，兩品系小鼠的掙扎不動時間顯著增長，表現(xiàn)為不可逃避環(huán)境下絕望狀態(tài)（p<0.001圖1F）。

2.2 社交挫敗應激造模與慢性不可應激造模結束后，Balb/c品系小鼠表現(xiàn)氣虛樣證候，129/S1則無此證候

社交挫敗造模后，Balb/c品系小鼠前爪最大抓力顯著減弱（p<0.01圖2A），掌紋血色度表現(xiàn)為顯著下降（p<0.001圖2B），在負重游泳時長上無顯著變化（p>0.05圖2C）；而造模后129/S1鼠在抓力、爪色上無顯著變化（p>0.05圖2AB），負重游泳潛伏期顯著縮短（p<0.01圖2C）。慢性不可預知應激造模后，Balb/c鼠前爪抓力同樣顯著下降（p<0.001圖2D），掌紋血色度表現(xiàn)為下降（p<0.01圖2E），負重游泳沉沒潛伏期顯著下降（p<0.001圖2F）；造模后的129/S1鼠在抓力與負重游泳時間上無顯著變化（p>0.05圖2DF），而掌紋血色度顯著上升（p<0.001圖2E）。

圖2 造模后Balb/c與129/S1兩品系小鼠的氣虛證候表型（ABC為社交挫敗造模后行為；DEF為慢性不可預知應激造模后行為）

2.3 越鞠丸可以改善CUMS后Balb/c小鼠和129/S1小鼠的抑郁樣行為。

CUMS造模結束后，Balb/c與129/S1模型組小鼠呈現(xiàn)出糖水偏好顯著降低，懸尾不動時間顯著升高的抑郁樣狀態(tài)(p<0.001，圖3ABDE)，在新奇環(huán)境攝食行為中，Balb/c模型組小鼠攝食潛伏期無顯著變化（圖3C）,而129/S1小鼠造模后的攝食潛伏期顯著增長，呈焦慮樣表現(xiàn)。給藥一周后行為學結果顯示，越鞠丸與氟西汀給藥能夠逆轉造模引起B(yǎng)alb/c小鼠在糖水偏好度、懸尾不動時間時間的變化（p<0.001圖3AB），降低Balb/c小鼠在新奇環(huán)境攝食的潛伏期，但未達到顯著性（p=0.06圖3C）。越鞠丸給藥均能逆轉129/S1小鼠造模后在糖水偏好、懸尾不動時間與新奇環(huán)境攝食潛伏期的變化（p<0.001圖3DEF），改善其抑郁焦慮樣行為。給予氟西汀不能逆轉129/S1小鼠的糖水偏好（p>0.05圖3D），但都能逆轉其懸尾不動時間與新奇環(huán)境攝食的指標（p<0.001圖3EF）。

圖3 越鞠丸給藥對CUMS造模后小鼠抑郁證候的影響，（ABC為Balb/c，DEF為129/S1）

圖4 越鞠丸給藥對CUMS造模后小鼠氣虛證候的影響，（ABC為Balb/c，DEF為129/S1）

圖5 越鞠丸給藥對CUMS造模后Balb/c和129/S1小鼠PKA-CREB信號通路的影響，AB為海馬組織，CD為肌肉組織）

2.4 越鞠丸未能逆轉CUMS應激后Balb/c小鼠的氣虛樣證候，對129/S1小鼠在氣虛樣指標上

CUMS造模結束后，進行氣虛樣行為檢測發(fā)現(xiàn)，Balb/c模型組小鼠前爪抓力顯著減弱（p<0.01圖4A），掌紋血色度表現(xiàn)為顯著降低（p<0.01圖4B），負重游泳沉沒潛伏時間顯著縮短（p<0.001圖4C），而進行一周越鞠灌胃給藥后，并不能逆轉小鼠在這些氣虛證候的指標（p>0.05圖4ABC），故越鞠丸無法改善Balb/c小鼠的氣虛樣證候，相比于模型組，氟西汀組小鼠抓力和爪色顯著上升（p<0.001）負重游泳潛伏期無變化（p>0.05圖4C）。CUMS造模后，129/S1小鼠在抓力、掌紋血色度、負重游泳潛伏期氣虛證候上無顯著變化，越鞠丸與氟西汀給藥對其氣虛證候均無影響。

2.5 越鞠丸給藥對CUMS造模后Balb/c和129/S1小鼠海馬與肌肉中PKA、p-CREB和CREB蛋白表達的影響

Western Blot的結果顯示，CUMS造模結束后，Balb/c和129/S1小鼠海馬與肌肉中PKA與p-CREB蛋白表達均顯著下降（圖5ABCD），在用越鞠丸和氟西汀治療后均能上調(diào)CUMS造模后Balb/c和129/S1小鼠海馬PKA與p-CREB蛋白的表達（圖5AB）；越鞠丸均能使造模后兩品系小鼠肌肉中PKA、p-CREB蛋白表達顯著上調(diào)，而氟西汀治療能顯著提高兩品系小鼠肌肉PKA蛋白水平，不能顯著上升p-CREB蛋白水平（圖5CD）。

3 討論

慢性不可預知應激模型較真實的模擬人類現(xiàn)實生活及社會自然環(huán)境中所遭遇的不可預知因素的影響[14]，社交挫敗能模擬人類社會中的社會心理應激，常用于抑郁癥及應激易感機制研究[15-16]。本研究采用這兩種造模方法對Balb/c和129/S1小鼠進行抑郁造模，CUMS造模后兩品系小鼠均出現(xiàn)糖偏愛顯著降低以及強迫游泳中掙扎不動時間延長失樂絕望的抑郁樣表型，SD造模后，Balb/c和129/S1兩品系小鼠均表現(xiàn)為不欲進行社會交互與糖水偏愛度下降的抑郁樣表型。Balb/c品系小鼠均表現(xiàn)氣虛樣證候，而129/S1品系均沒有表現(xiàn)氣虛樣證候。兩品系抑郁小鼠在給與越鞠丸后，都能產(chǎn)生抗抑郁作用，均能改善外周海馬和肌肉的PKA-CREB信號通路蛋白表達。

臨床抑郁病人表現(xiàn)出多種中醫(yī)證候，除氣郁證候外，氣虛是常見的證候之一。研究的結果表明，Balb/c小鼠遺傳體質具有氣虛易感性：在不同的應激模型下，Balb/c小鼠都穩(wěn)定呈現(xiàn)出了氣虛樣的表現(xiàn)，而氣虛非易感性的129/S1小鼠則無此表現(xiàn)，盡管兩個品系的小鼠都表現(xiàn)出抑郁樣的行為，即Balb/c小鼠在應激后同時表現(xiàn)出抑郁（?。┡c氣虛（證）易感性，可以作為研究抑郁伴隨氣虛的病證機制及其治療穩(wěn)定可靠的模式動物。129/S1小鼠在兩種方法造模后都出現(xiàn)抑郁樣行為，SD后負重游泳時間下降及CUMS爪色上升，可能為氣郁致血行不暢甚至瘀阻而使爪色度上升，也可能氣郁化火，灼傷津液，使其抗疲勞能力不足，此現(xiàn)象在以往皮質酮模型中也類似[11]，但是在CUMS模型中都沒有，提示不同的模型條件對證候也一定的影響。盡管如此，Balb/c的氣虛證候在所有的模型中，都表現(xiàn)出較好的穩(wěn)定性,顯示遺傳對證候的基礎性作用。

越鞠丸出自《丹溪心法》，理氣行氣劑，為治療郁證代表方。臨床證據(jù)表明越鞠丸能夠治療氣郁體質及兼夾體質抑郁癥患者[17-18]。本實驗研究結果顯示，給予慢性不可應激造模后的兩小鼠越鞠丸治療一周后，越鞠丸均能改善兩品系小鼠的抑郁證候，即使Balb/c小鼠表現(xiàn)出氣虛證候抑郁癥。大量研究結果表明PKA-CREB信號通路與抑郁癥有關[19-20]。越鞠丸可以通過調(diào)節(jié)PKA及CREB蛋白來達到治療抑郁癥的作用[8][21]。本研究對Balb/c小鼠海馬蛋白表達的結果顯示，PKA與p-CREB蛋白表達量在模型組顯著下調(diào)，而給予越鞠丸治療后能逆轉該下調(diào)，在129/S1品系得到的蛋白表達結果與Balb/c品系一致，提示PKA及CREB蛋白的變化是越鞠丸在Balb/c與129/S1品系小鼠上起抗抑郁作用的共同基礎。由于肌肉與氣虛行為的密切關系，我們也檢測肌肉PKA-CREB信號，發(fā)現(xiàn)Balb/c品系確實下降。比較意外的是越鞠丸可以逆轉該下降，盡管對抓力行為沒有作用。而且129S1品系也在造模后下降，并被越鞠丸逆轉，提示肌肉PKA信號與抑郁的關系比證候的更密切，還需要進一步研究。

從遺傳學的角度，氣虛體質是具有氣虛易感性的遺傳體質類型，在病理條件下，與非氣虛體質比，易于出現(xiàn)氣虛證候的癥狀與體征。在不同的疾病病因誘導下，氣虛體質者都可以呈現(xiàn)出氣虛證候，即使疾病類型各有不同，這是中醫(yī)異病同治的生物學基礎之一。某種程度而言，氣虛體質是氣虛證候的必要條件，氣虛體質產(chǎn)生氣虛證候一般還需要疾病環(huán)境的誘導。以行氣解郁為主要功效的越鞠丸可以逆轉兩品系小鼠在CUMS造模后的抑郁樣行為，卻不能逆轉Balb/c小鼠的氣虛樣證候；而之前的研究[22]顯示益氣藥四君子湯只能逆轉Balb/c小鼠的抑郁伴氣虛樣行為，而對129/S1沒有作用。提示越鞠丸對抑郁癥具有治病的特點，其作用不是通過改善氣虛證候來實現(xiàn)的，符合中醫(yī)理論預期。反之，四君子湯對抑郁癥的治療，是通過對氣虛證候的干預實現(xiàn)的，無氣虛證候也就沒有治療效果，同樣符合中醫(yī)理論。從實驗上證明了中醫(yī)辨證論治的科學性與必要性。本研究對不同遺傳背景的小鼠進行CUMS和SD方法造模，結果支持Balb/c品系小鼠是抑郁伴氣虛樣證候的良好模型，有利于促進相關藥物開發(fā)和機制等探索。下一步將進行深入刻畫該抑郁伴氣虛模型更為細致的病證特點和相關生物學基礎。