吳麗娜，謝小本，劉東紅，葉興乾，尹源明，周建偉，5，丁 甜，4

(1 浙江大學(xué)生物系統(tǒng)工程與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 310058；2 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室暨天津市工業(yè)微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(天津科技大學(xué))，天津 300457；3 紹興咸亨食品股份公司，浙江紹興 312000；4 浙江大學(xué)馥莉食品研究院，杭州 310058；5 浙江大學(xué)寧波理工學(xué)院，浙江寧波 315100)

腌制是我國(guó)最常用的蔬菜加工方法，腌制蔬菜因其工藝簡(jiǎn)單，便于保存，風(fēng)味獨(dú)特而且能增進(jìn)食欲，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。蔬菜腌制是指在蔬菜中加入食鹽或者發(fā)酵劑，來(lái)改變蔬菜口感風(fēng)味，提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的一種加工方法。腌制蔬菜按其加工工藝可分為醬漬菜、糖醋漬菜、糟漬菜、糠漬菜、鹽水漬菜6類(lèi)[3]。我國(guó)的腌制蔬菜種類(lèi)繁多，比較出名的有涪陵榨菜、四川泡菜、東北酸菜等。

發(fā)酵作用是利用微生物分解蔬菜營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的產(chǎn)物，以及某些微生物本身的味道來(lái)增加蔬菜的風(fēng)味和口感。發(fā)酵作用可分為乳酸發(fā)酵、酒精發(fā)酵、醋酸發(fā)酵和丁酸發(fā)酵等。乳酸發(fā)酵生成的乳酸，可以給蔬菜帶來(lái)獨(dú)特的酸味，也可以抑制有害菌的生長(zhǎng)，有防腐效果；酒精發(fā)酵和醋酸發(fā)酵產(chǎn)生的少量乙醇與酯類(lèi)，可以增加蔬菜的特殊香味，有增進(jìn)食欲的效果；丁酸發(fā)酵生成的丁酸，會(huì)加速蔬菜的腐敗，也影響風(fēng)味。因?yàn)槿樗峋羌嫘詤捬蹙L(zhǎng)繁殖不需要空氣，而大多數(shù)有害菌均是好氣菌，所以蔬菜腌制時(shí)要隔絕空氣。本文腌制蔬菜微生物研究現(xiàn)狀以及菌種鑒定方式。

1 蔬菜腌制過(guò)程中的主要微生物

1.1 乳酸菌

乳酸菌是一種兼性厭氧菌，在蔬菜腌制中具有重要作用，能提高營(yíng)養(yǎng)價(jià)值、改善食品風(fēng)味、預(yù)防腐敗變質(zhì)。在蔬菜的起始發(fā)酵和主發(fā)酵階段，占優(yōu)勢(shì)的乳酸菌主要有植物乳桿菌、短乳桿菌、膜狀明串珠菌、戊糖片球菌等[9]。

楊珺等[10]采用常規(guī)微生物培養(yǎng)方法，對(duì)四川榨菜后熟階段微生物區(qū)進(jìn)行研究，分離得到的細(xì)菌參照《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》和《一般細(xì)菌常用鑒定方法》做相關(guān)的生理生化試驗(yàn)和形態(tài)觀察，分別歸于9個(gè)屬，12種菌，經(jīng)進(jìn)一步的試驗(yàn)工作，其中乳酸菌主要為植物乳桿菌、發(fā)酵乳桿菌、乳酸片球菌、戊糖片球菌等。李正國(guó)等[11]采用基于16SrRNA作為分子標(biāo)記的變性梯度凝膠電泳(DGGE)方法，分析榨菜腌制過(guò)程中不同時(shí)期的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)，分離鑒定得到7個(gè)屬的細(xì)菌類(lèi)群，乳酸菌中乳桿菌是優(yōu)勢(shì)菌群，另外還測(cè)出片球菌。在發(fā)酵初期，明串珠菌是優(yōu)勢(shì)菌；發(fā)酵中期，明串珠菌受到抑制，乳酸細(xì)菌迅速成為優(yōu)勢(shì)菌；發(fā)酵后期，乳酸菌也受到抑制。

1.2 酵母菌

酵母是一些單細(xì)胞真菌，是一種典型的兼性厭氧微生物，在有氧和無(wú)氧條件下都能夠存活；同時(shí)也是一種天然發(fā)酵劑，常用于制作面包和蔬菜腌制。蔬菜腌制中常見(jiàn)的酵母主要是啤酒酵母、產(chǎn)醭酵母和魯氏酵母等[1]。張騰[14]采用PCR-DGGE方法分析研究不同鹽濃度蔬菜發(fā)酵過(guò)程中的細(xì)菌、真菌，結(jié)果表明，食鹽濃度4%的發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌體系包括假單胞菌、沙雷氏菌、泛菌及松鼠葡萄球菌等，而真菌微生物主要有Wickerhamomycesanomalus、假絲酵母、季也蒙酵母；食鹽濃度6%的發(fā)酵蔬菜細(xì)菌體系中含有檸檬明串珠菌和腸系膜明串珠菌以及腸桿菌、泛菌，真菌微生物主要包括釀酒酵母、季也蒙酵母、漢遜德巴利氏酵母、畢赤酵母等；食鹽濃度8%的發(fā)酵蔬菜細(xì)菌體系中包括沙雷氏菌、拉恩氏菌以及松鼠葡萄球菌，真菌微生物主要為假絲酵母、畢赤酵母、Wickerhamomycesanomalus及馬克斯克魯維酵母。

1.3 醋酸菌

在腌制過(guò)程中，原料蔬菜表面附著的少量醋酸菌能在有氧條件下將酒精氧化為醋酸。在蔬菜腌制過(guò)程中多為桿菌，如膜醋酸桿菌、黑醋酸菌和紅醋酸菌等[1]。孟憲剛等[15]采用傳統(tǒng)分離鑒定法對(duì)發(fā)酵蔬菜漿水中優(yōu)勢(shì)好氧微生物進(jìn)行研究，得到8株酵母菌和1株細(xì)菌，初步鑒定酵母菌歸入3個(gè)屬，分別是酒香酵母屬、瓶形酵母屬和假絲酵母屬；將細(xì)菌初步歸為醋酸桿菌屬。

1.4 霉菌

霉菌是真菌的一部分，菌絲發(fā)達(dá)，在蔬菜腌制過(guò)程中為有害菌，會(huì)導(dǎo)致蔬菜組織軟化，口感變差，引起嚴(yán)重腐敗，霉菌的大量繁殖也會(huì)影響蔬菜的外觀。在蔬菜腌制過(guò)程中常見(jiàn)的霉菌主要有青霉、交鏈孢霉、鐮刀霉等[1]。楊珺等[10]采用常規(guī)微生物培養(yǎng)方法，對(duì)四川榨菜后熟階段微生物區(qū)進(jìn)行研究，分離得到的細(xì)菌分別歸于9個(gè)屬，12種菌，其中霉菌鑒定出2個(gè)屬，分別是青霉屬和曲霉屬。

1.5 其他細(xì)菌

在蔬菜腌制的初期還有另外一些細(xì)菌活動(dòng)，如大腸桿菌、丁酸菌、丙醋桿菌和丙醋梭菌等[1]。何鵬暉等[16]以發(fā)酵蔬菜為研究對(duì)象，采用16S rDNA對(duì)其中形成腐敗膜醭的主要微生物進(jìn)行鑒定研究，利用胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基分離培養(yǎng)發(fā)酵蔬菜腐敗膜醭中的微生物，挑取50株單克隆回接到發(fā)酵鹽鹵胰蛋白胨培養(yǎng)基中培養(yǎng)，將能夠在培養(yǎng)液表面顯著形成膜醭的菌株進(jìn)行鑒定，共分離鑒定出6株細(xì)菌，分別為枯草芽孢桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、科氏葡萄糖球菌科氏亞種、普羅威登斯菌、克雷伯氏桿菌屬和陰溝腸桿菌。

2 影響腌制蔬菜中微生物的環(huán)境因子

2.1 鹽度

腌制蔬菜含鹽量一般為泡酸菜0～4%、咸菜類(lèi)10%～14%、糖醋菜1%～3%、鹽漬菜25%。大多數(shù)微生物細(xì)胞滲透壓力為3.54×105～1.62×106Pa，1%的食鹽產(chǎn)生1.8×104Pa的滲透壓。3%～5%的食鹽抑制大多數(shù)腐敗細(xì)菌，10%的食鹽對(duì)乳酸菌、大腸桿菌、丁酸菌產(chǎn)生抑制作用，酵母菌耐鹽性較強(qiáng)，受鹽度影響較小。李軍波[17]采用自然發(fā)酵和強(qiáng)化發(fā)酵2種發(fā)酵方式對(duì)2%、5%、8%(w/v)3種食鹽濃度的泡菜進(jìn)行了研究并發(fā)現(xiàn)了：(1)2%食鹽濃度中乳酸菌的繁殖代謝最快；5%濃度能較好地抑制真菌和大腸桿菌的繁殖；8%濃度減緩了乳酸菌的繁殖代謝。(2)鹽濃度低于2%時(shí)，食品乳桿菌緩慢生長(zhǎng)；鹽濃度高于2%時(shí)，食品乳桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，數(shù)量也逐漸降低。但相比于植物乳桿菌和腸膜明串珠菌，食品乳桿菌的耐鹽性更好。

2.2 溫度

微生物都需要適宜的溫度才能正常的生長(zhǎng)繁殖。乳酸菌活動(dòng)的最適溫度為26～30℃，醋酸菌適宜溫度為25～30℃、酵母菌適宜溫度為25～28℃、大多數(shù)霉菌適宜溫度為25～30℃。腌制過(guò)程中的發(fā)酵溫度應(yīng)該保持在12～22℃之間，既保證了乳酸菌的發(fā)育，又能抑制腐敗菌的繁殖。腌制過(guò)程中難免有雜菌產(chǎn)生，比如丁酸菌的適宜溫度是35℃，為了延長(zhǎng)腌制蔬菜的保質(zhì)期，應(yīng)將貯藏環(huán)境溫度降低，最好放冰箱里。

2.3 酸度

蔬菜腌制中幾種主要微生物所能忍受的最低pH為：霉菌1.2～3.0、丁酸菌4.5、大腸桿菌5～5.5、乳酸菌3.0～4.4、腐敗細(xì)菌4.4～5.0、酵母菌2.5～3.0[1]。所以一般在腌制后熟階段，把腌漬液的pH控制在4.5以下，就能控制有害微生物的生長(zhǎng)繁殖。

2.4 氣體成分

蔬菜腌制時(shí)一般都要壓緊或密封，或者用鹽水淹沒(méi)來(lái)隔絕空氣。因?yàn)槿樗峋羌嫘詤捬蹙?，在隔絕空氣狀態(tài)下能進(jìn)行正常的發(fā)酵，而以霉菌為主的有害微生物都是需氧菌，通過(guò)隔絕空氣的措施可抑制它們的生長(zhǎng)發(fā)育，來(lái)保證腌制蔬菜的品質(zhì)。

2.5 蔬菜品種

蔬菜本身提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是乳酸菌進(jìn)行發(fā)酵作用的條件之一。原料蔬菜中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)含量多少會(huì)影響發(fā)酵速度和酸性產(chǎn)物的生成。相同條件下，含糖量越多的蔬菜能令乳酸發(fā)酵越快。一般用于腌制的蔬菜，含糖量在1.5% ～3%比較合適，如果發(fā)酵效果不明顯，可以適當(dāng)添加一些糖。

3 腌制蔬菜微生物的鑒定技術(shù)

腌制蔬菜微生物的鑒定技術(shù)見(jiàn)附表。

3.1 傳統(tǒng)菌種鑒定技術(shù)

傳統(tǒng)的菌種鑒定技術(shù)有菌落形態(tài)觀察、革蘭氏染色、鞭毛染色、糖類(lèi)分解試驗(yàn)、吲哚(靛基質(zhì))試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、V-P試驗(yàn)、甲基紅試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、接觸酶試驗(yàn)等。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)檢驗(yàn)與鑒定的主要依據(jù)是形態(tài)特征和生理形狀進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)及一系列生化反應(yīng)或免疫學(xué)檢測(cè)。方法復(fù)雜費(fèi)時(shí)，對(duì)有些細(xì)菌也往往不能給出理想的結(jié)果。

3.2 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)(PCR)

PCR技術(shù)是1985年由MULLIS發(fā)明的一種聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，是DNA的體外擴(kuò)增技術(shù)，原理類(lèi)似于DNA的體內(nèi)復(fù)制過(guò)程，需要模版DNA、寡核苷酸引物、DNA

附表 腌制蔬菜菌群鑒定技術(shù)

聚合酶、4種脫氧核苷三磷酸(dNTP)原料和合適的緩沖液體系，在一定的溫度下，經(jīng)過(guò)重復(fù)的過(guò)程，就能完成DNA的體外合成。PCR技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是能在短時(shí)間內(nèi)將目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，以便對(duì)已知DNA片段進(jìn)行分析。以PCR技術(shù)為基礎(chǔ)的PCR-DGGE技術(shù)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)在發(fā)酵蔬菜的微生物研究有廣泛應(yīng)用。

3.2.1PCR-DGGE技術(shù) PCR-DGGE技術(shù)是近幾年比較熱門(mén)的分子鑒定技術(shù)，它主要是通過(guò)在電泳凝膠中加入尿素和甲酰胺等變性劑，從而區(qū)分相同長(zhǎng)度不同序列的DNA片段。DGGE技術(shù)可以用于特定菌的存在，也能發(fā)現(xiàn)沒(méi)有被分離鑒定的菌種，還能監(jiān)測(cè)菌群結(jié)構(gòu)的變化，在食品微生物分析中應(yīng)用廣泛。但是PCR-DGGE也有缺點(diǎn)，它對(duì)含量較低的菌群無(wú)法檢測(cè)，也很難區(qū)分相似度高的菌種。為了確保分辨率，用于DGGE分析的PCR產(chǎn)物一般要求長(zhǎng)度在500bp以下。DGGE技術(shù)的缺陷是電泳的共遷移現(xiàn)象會(huì)對(duì)測(cè)序結(jié)果有所影響。荊雪嬌等[25]采用PCR-DGGE技術(shù)，分析了市售9種發(fā)酵蔬菜中細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明，所有的發(fā)酵蔬菜中均存在植物乳桿菌，但在醬菜中含量比較少；另外含量較多的還有短乳桿菌、彎曲乳桿菌、消化乳桿菌和食用糖乳桿菌；在不同加工工藝中，泡菜工藝下真菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最高；酸菜工藝下真菌群落結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性最差。

3.2.2實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù) 實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是在DNA擴(kuò)增反應(yīng)中加入熒光基團(tuán)，每次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的進(jìn)行，熒光信號(hào)會(huì)逐漸累積，循環(huán)后測(cè)出產(chǎn)物總量的方法，該技術(shù)能夠使整個(gè)PCR反應(yīng)過(guò)程被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線可以對(duì)未知的模版進(jìn)行定量分析。熒光定量PCR技術(shù)精度高，在發(fā)酵食品中主要菌群的分布及豐度，發(fā)現(xiàn)新的微生物具有重要意義。

3.3 基因測(cè)序技術(shù)

基因測(cè)序技術(shù)的發(fā)展可分為三代：毛細(xì)管電泳測(cè)序技術(shù)、高通量測(cè)序技術(shù)、單分子測(cè)序技術(shù)。

3.3.1第一代測(cè)序技術(shù) 第一代測(cè)序技術(shù)的理論依據(jù)是Sanger建立的“DNA雙脫氧鏈末端終止測(cè)序法”和Maxam-Gilbert 化學(xué)降解法。Sanger法利用雙脫氧核苷三磷酸(ddNTP)比dNTP缺少3’-OH，能使引物與目的DNA的延伸反應(yīng)停止這一原理建立4個(gè)反應(yīng)，分別加入足量的4種dNTP和不同的被同位素標(biāo)記的ddNTP，通過(guò)聚合酶合成能與目的DNA互補(bǔ)的片段，由于ddNTP的存在，會(huì)形成不同長(zhǎng)度的DNA延伸片段，將4個(gè)反應(yīng)的產(chǎn)物分4個(gè)泳道用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行分離，便可以按順序讀出相應(yīng)的DNA序列。熒光標(biāo)記技術(shù)出現(xiàn)后，逐漸取代同位素標(biāo)記技術(shù)，在Sanger法中，可以用不同熒光標(biāo)記4種ddNTP，在一個(gè)泳道的尿素變性的PAGE膠上電泳分析，然后通過(guò)檢測(cè)不同波長(zhǎng)的信號(hào)，用計(jì)算機(jī)分析信號(hào)后即可獲得目的DNA的堿基序列。Maxam-Gilbert化學(xué)降解法其原理是將目的DNA片段的5’端作放射性標(biāo)記，然后設(shè)計(jì)5個(gè)獨(dú)立的反應(yīng)，每個(gè)反應(yīng)中分別用不同試劑將目的DNA切割成重復(fù)的堿基片段，通過(guò)凝膠電泳分離，根據(jù)不同條帶的顯示情況，可以分析出各片段末端堿基，從而確定目的DNA的堿基序列。

化學(xué)降解法與Sanger法相比，是直接用目的DNA的片段來(lái)進(jìn)行電泳分析，而不是通過(guò)酶合成的與目的DNA互補(bǔ)的片段進(jìn)行測(cè)序，能夠有效避免酶合成出錯(cuò)導(dǎo)致測(cè)序結(jié)果偏差。但化學(xué)降解法的操作過(guò)于復(fù)雜，漸漸被Sanger法代替。

3.3.2第二代測(cè)序技術(shù) 高通量基因測(cè)序技術(shù)是對(duì)毛細(xì)管電泳技術(shù)一次革命性的改變，高通量測(cè)序設(shè)備運(yùn)行一次可以實(shí)現(xiàn)對(duì)幾十萬(wàn)到幾百萬(wàn)條DNA分子進(jìn)行序列測(cè)定，每次運(yùn)行所獲得的數(shù)據(jù)量是Mbp。目前，高通量測(cè)序平臺(tái)的代表有羅氏公司的454 測(cè)序儀、美國(guó)Illumina公司推出的Solexa基因組分析平臺(tái)、ABI公司自主研發(fā)的SOLiD 測(cè)序儀[23]。

孫慧君等[20]采用Illumina高通量測(cè)序方法對(duì)27份傳統(tǒng)發(fā)酵錦州小菜微生物多樣性進(jìn)行研究，共檢測(cè)到5種已知細(xì)菌門(mén)，53種細(xì)菌屬，乳桿菌屬、藍(lán)細(xì)菌屬是優(yōu)勢(shì)菌屬；檢測(cè)出的20種真菌屬中，2種酵母菌目屬、Hyphopichia屬、畢赤酵母屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，青霉菌屬在所有樣品中測(cè)出。

侯強(qiáng)川等[24]采用454焦磷酸測(cè)序技術(shù)對(duì)采集自俄羅斯埃利斯塔市郊的2份發(fā)酵蔬菜樣品中的細(xì)菌進(jìn)行了分析，分別獲得了10 869和12 204條高質(zhì)量序列。經(jīng)過(guò)與RDP數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)，結(jié)果表明，乳桿菌屬占細(xì)菌總數(shù)的91.66%，成為絕對(duì)優(yōu)勢(shì)菌，乳球菌屬占細(xì)菌總數(shù)的3.81%，成為次級(jí)優(yōu)勢(shì)菌。另外，還鑒定出了弧菌屬、片球菌屬、腸球菌屬、克魯維菌屬等。

3.3.3第三代測(cè)序技術(shù) Helicos單分子測(cè)序儀、Pacific Bioscience的SMRT技術(shù)(圖1)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子測(cè)序技術(shù)(圖2)，這三種技術(shù)被稱(chēng)為第三代測(cè)序技術(shù)[38，40]。不同于第二代測(cè)序依賴于DNA模版和PCR擴(kuò)增，采用邊合成邊測(cè)序的方法，第三代測(cè)序方法具有更高通量、更短時(shí)間、更精確等優(yōu)點(diǎn)。

韓琬[26]采用單分子測(cè)序技術(shù)對(duì)日本清酒曲樣品細(xì)菌和真菌多樣性進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，共有39 121條高質(zhì)量序列生成，通過(guò)序列分析將這些基因序列歸類(lèi)為5格細(xì)菌門(mén)和2格真菌門(mén)，優(yōu)勢(shì)菌門(mén)分別為變形菌門(mén)和子囊菌門(mén)。

圖1 SMRT 技術(shù)原理[25]

圖2 納米孔單分子測(cè)序技術(shù)原理[27]

4 結(jié)論

蔬菜腌制是一種冷加工方式，相比于熱加工，在風(fēng)味和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值上都有巨大的優(yōu)越性。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展和生活水平的提高，人們對(duì)營(yíng)養(yǎng)健康的高品質(zhì)腌制蔬菜的需求也與日俱增。腌制蔬菜的品質(zhì)取決于發(fā)酵微生物，因此，對(duì)傳統(tǒng)腌制蔬菜的微生物研究及控制顯得越來(lái)越重要。

從目前我國(guó)對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中優(yōu)勢(shì)菌群的多樣性研究方法來(lái)看，傳統(tǒng)分離鑒定法依然占據(jù)主導(dǎo)，分離出的菌群種類(lèi)和數(shù)量少，很多菌種都無(wú)法檢測(cè)出。因此，基因測(cè)序技術(shù)的完善和推廣變得越來(lái)越重要，基因測(cè)序技術(shù)精度高，簡(jiǎn)便快捷，能鑒定出大量傳統(tǒng)分離鑒定法無(wú)法檢測(cè)的菌株，有利于加深我們對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵蔬菜中微生物菌群的了解，進(jìn)一步闡明發(fā)酵蔬菜品質(zhì)形成的機(jī)制。但是每種方法本身也有局限性，比如DGGE技術(shù)的電泳共遷移現(xiàn)象；高通量測(cè)序在測(cè)序前要通過(guò)PCR手段擴(kuò)增，因此增加了測(cè)序的錯(cuò)誤率等，所以在進(jìn)行微生物多樣性分析時(shí)，合理選擇不同方法進(jìn)行結(jié)果比較顯的尤為重要。但筆者覺(jué)得在不久的將來(lái)，伴隨著基因測(cè)序技術(shù)的成熟，對(duì)腌制蔬菜菌群變化的研究也將更加深入。◇