李娜坤，王雪萌，劉黎瑤,,通信作者，王慶奎

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黃芩提取物抗紫外輻射作用的體外研究

李娜坤a，王雪萌a，劉黎瑤a,b,通信作者，王慶奎b

（天津農(nóng)學(xué)院a. 基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院，b. 天津市水產(chǎn)生態(tài)及養(yǎng)殖重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300384）

某些中藥提取物含有的黃酮類有效成分，對(duì)于紫外線具有廣譜吸收能力，能夠清除紫外輻射所誘導(dǎo)產(chǎn)生的活性氧自由基，從而發(fā)揮輻射保護(hù)作用。本研究中，利用超聲提取法得到黃芩提取物，測(cè)定了總黃酮類有效物質(zhì)的含量，通過紫外全波長掃描，確認(rèn)該提取物具有吸收紫外輻射的效果。研究了不同質(zhì)量濃度黃芩提取物對(duì)于活性氧化自由基——羥基自由基以及超氧陰離子的清除作用，并以大腸桿菌作為模型菌體進(jìn)行了體外輻射試驗(yàn)，證實(shí)了黃芩總黃酮提物具有抗紫外輻射的作用，且該作用具有劑量依賴性。

黃芩提取物；抗紫外輻射；清除自由基；體外研究

1 儀器與試劑

1.1 儀器

電子天平（Sartorius，BSA 223S）；超聲波清洗儀（寧波新芝生物科技股份有限公司，SB-5200DT型）；紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）；低速離心機(jī)（長沙湘儀儀器有限公司，L550）；超凈工作臺(tái)（蘇凈基團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司，SW-CJ-2FD）；高速粉碎機(jī)、恒溫水浴鍋等。

1.2 試藥和試劑

中藥黃芩飲片（購于北京同仁堂大藥房，產(chǎn)地：內(nèi)蒙古）；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（中國藥品生物制品檢定院，HPLC≥98%）；無水乙醇（天津市大茂化學(xué)試劑廠，分析純）；水楊酸、硫酸亞鐵、氫氧化鈉、氯化鈉（天津市風(fēng)船化學(xué)試劑有限公司，分析純）；三羥甲基氨基甲烷（源葉生物，分析純）；鄰苯三酚（北京索萊寶科技有限公司，分析純）；其他試劑均為生物試劑級(jí)別。

1.3 試驗(yàn)菌株

大腸桿菌由天津農(nóng)學(xué)院基礎(chǔ)科學(xué)學(xué)院生物制藥實(shí)驗(yàn)室提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 黃芩總黃酮提取物的提取方法

稱取適量中藥黃芩，洗凈并干燥至恒重，用高速粉碎機(jī)粉碎，過60目篩。參考文獻(xiàn)[4]中的方法，在輔助加熱條件下對(duì)黃芩細(xì)粉進(jìn)行超聲提取。具體提取方法為：稱取30 g黃芩細(xì)粉置于250 mL三角瓶中，向其中加入100 mL 體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇，在60 ℃水浴條件下進(jìn)行超聲提取45 min，放涼至室溫，用濾紙過濾，取濾液，于4 000 r/min條件下離心20 min，對(duì)上清液進(jìn)行水浴加熱濃縮，至提取物質(zhì)量濃度約為1 g/mL，作為黃芩提取物浸膏液，密封置于4 ℃條件下，備用。

2.2 紫外全波長掃描

田笑著開車走了，車子帶起的秋風(fēng)把女人推了一下，使她立馬就打了個(gè)冷戰(zhàn)。她一邊裹緊了風(fēng)衣朝前走，一邊想看來只能單身一輩子了。

2.3 黃芩提取物中總黃酮含量的測(cè)定[5]

2.3.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱定10 mg蘆丁對(duì)照品置于容量瓶中，加無水乙醇溶解并定容至100 mL，配制成100 μg/mL儲(chǔ)備液。吸取適量儲(chǔ)備液稀釋，配制成質(zhì)量濃度為2、4、6、8、10 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。按紫外分光光度法，測(cè)定不同質(zhì)量濃度蘆丁系列溶液在260 nm處的吸光度。以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取蘆丁對(duì)照品系列溶液，通過紫外分光光度法，測(cè)定其在260 nm處的吸光度，連續(xù)重復(fù)測(cè)定5次，記錄吸光度數(shù)值，并計(jì)算值。

2.3.3 加樣回收率試驗(yàn)

稱取適量已經(jīng)確定總黃酮含量的黃芩提取物，量取適量的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液加至其中，使蘆丁對(duì)照品最終質(zhì)量濃度分別為2、6、10 μg/mL（＝3）。經(jīng)微孔濾膜過濾之后，取續(xù)濾液，按紫外分光光度法，測(cè)定其在260 nm處的吸光度，計(jì)算對(duì)照品的加樣回收率。

基于在短時(shí)間內(nèi)“云動(dòng)雪不變”的假設(shè)，即云層在不斷運(yùn)動(dòng)，觀測(cè)值隨時(shí)間變化，而積雪相對(duì)固定，一段時(shí)間內(nèi)不會(huì)變化.選取一定時(shí)間段內(nèi)同一區(qū)域的多幅高分四號(hào)全色圖像，采用以上方式提取具有高反射值的云雪覆蓋區(qū).按照短時(shí)間內(nèi)“云動(dòng)雪不變”的思想，同一處位置的像元在每個(gè)時(shí)相影像中均被檢測(cè)出是云雪，則會(huì)被進(jìn)一步確認(rèn)為是不變的積雪像元，否則就認(rèn)為是由于運(yùn)動(dòng)云層造成的亮像元而予以去除.通過對(duì)多時(shí)相高分四號(hào)衛(wèi)星云雪監(jiān)測(cè)范圍進(jìn)行累計(jì)合成運(yùn)算，能盡可能消除移動(dòng)云層的影響，將各個(gè)時(shí)相上均被識(shí)別為雪的區(qū)域作為積雪覆蓋范圍.

稱取1 g黃芩提取物浸膏液，加蒸餾水稀釋至10 μg/mL，經(jīng)微孔濾膜過濾后，用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定續(xù)濾液在200～400 nm波長下紫外吸收情況，并記錄該波段的掃描光譜圖。

當(dāng)車輪以很高的速度沿鋼軌滾動(dòng)時(shí)，它受到的輪軌作用力是一個(gè)沿其滾動(dòng)圓高速移動(dòng)的荷載。這個(gè)相對(duì)車輪快速旋轉(zhuǎn)的作用力不但包含一個(gè)靜力成分，即一半的軸荷載，同時(shí)也包含許多由于輪軌相互作用而產(chǎn)生的高頻成分，其頻率高達(dá)4～5 kHz。移動(dòng)荷載會(huì)給車輪產(chǎn)生波動(dòng)效應(yīng)，同時(shí)，車輪的旋轉(zhuǎn)會(huì)引入離心和陀螺效應(yīng)?？梢栽O(shè)想，高速旋轉(zhuǎn)車輪的動(dòng)力學(xué)特性一定不同于非旋轉(zhuǎn)車輪的動(dòng)力學(xué)特性，而且前者比后者更復(fù)雜。

2.4 自由基清除試驗(yàn)

2.4.1 羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn)

量取適量黃芩提取物浸膏至容量瓶中，用無水乙醇稀釋定容。經(jīng)微孔濾膜過濾之后，通過紫外分光光度法，測(cè)定續(xù)濾液在波長260 nm下的吸光度，利用標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程，計(jì)算黃芩提取物中總黃酮含量。

對(duì)動(dòng)物常見疫病進(jìn)行分析，有利于進(jìn)一步提升動(dòng)物疫病防治工作的整體開展水平，有效保證我國畜牧養(yǎng)殖事業(yè)整體開展水平。由于我國動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)工作起步較晚，大部分監(jiān)測(cè)技術(shù)和方式應(yīng)用還不完善，監(jiān)測(cè)人員通常需要在應(yīng)用規(guī)范監(jiān)測(cè)方式的基礎(chǔ)上結(jié)合自身經(jīng)驗(yàn)，這種形勢(shì)對(duì)我國動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)工作的高質(zhì)量進(jìn)行造成阻礙，同時(shí)也降低了疫病監(jiān)測(cè)的準(zhǔn)確率[1]。因此，監(jiān)測(cè)機(jī)構(gòu)和工作人員有必要分析和總結(jié)動(dòng)物常見疫病，首先應(yīng)明確動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)中常見疫病，進(jìn)行動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)中常見疫病分析，主要可將研究內(nèi)容歸納為動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)中常見疫病以及動(dòng)物疫病監(jiān)測(cè)常見疫病的誘因2方面，具體研究內(nèi)容總結(jié)歸納如下。

利用Fenton反應(yīng)產(chǎn)生·OH體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ蚚6-8]，研究不同質(zhì)量濃度的黃芩提取物清除·OH的作用。具體試驗(yàn)方法為：首先，設(shè)置3個(gè)黃芩提取物濃度組（10、50以及100 mg/mL），依次加入0.75 mL 8 mmol/L水楊酸鈉溶液、1.0 mL 6 mmol/L硫酸亞鐵溶液以及0.5 mL各質(zhì)量濃度的樣品溶液，最后向試管中加入0.75 mL 24 mmol/L過氧化氫溶液啟動(dòng)反應(yīng)。將上述反應(yīng)體系置于37 ℃水浴條件下，避光孵育60 min，測(cè)定其在510 nm處的吸光度。每質(zhì)量濃度設(shè)3組平行試驗(yàn)，以蒸餾水作為空白對(duì)照。通過公式（1）計(jì)算·OH的體外清除率。

清除率（%）＝[空白-（樣品-本底）] /空白×100（1）

其中，空白為空白對(duì)照組的吸光度；樣品為加入樣品溶液后的吸光度；本底為未加入顯色劑過氧化氫時(shí)藥物溶液本底的吸光度。

四是做好培訓(xùn)工作。做好對(duì)博士后、研究團(tuán)隊(duì)、應(yīng)用單位技術(shù)人員的培訓(xùn)，提升研究、應(yīng)用、轉(zhuǎn)化能力，構(gòu)建智力開發(fā)與傳播平臺(tái)，以提升應(yīng)用轉(zhuǎn)化成果的能力，擴(kuò)大影響、加快成果傳播、創(chuàng)造轉(zhuǎn)化機(jī)會(huì)。

清除率（%）＝（空白-樣品）/空白×100（2）

其中，空白為空白對(duì)照組的吸光度；樣品為加入樣品溶液后的吸光度

2.5 體外菌體輻射試驗(yàn)[11-12]

在無菌操作條件下，取處于對(duì)數(shù)生長期的大腸桿菌，加入適量滅菌生理鹽水制備成大腸桿菌懸液。取無菌試管，分別向其中依次加入1 mL大腸桿菌懸液以及1 mL各質(zhì)量濃度的樣品溶液，振搖混勻后，分別移取100 μL菌懸液進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，記錄總菌數(shù)。將上述試管接受紫外照射，照射時(shí)長為30 s。用滅菌蒸餾水代替樣品溶液作為空白對(duì)照組。紫外輻射結(jié)束后，再移取100 μL菌懸液至細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，滴加1滴0.02%亞甲藍(lán)染色，能夠被亞甲藍(lán)染成藍(lán)色的細(xì)胞即為死亡細(xì)胞。通過公式（3）計(jì)算大腸桿菌存活率。

大腸桿菌存活率（%）＝（活菌數(shù)量/總菌數(shù)）×100（3）

3 結(jié)果與分析

3.1 紫外全波長掃描結(jié)果

3.2.3 加樣回收率測(cè)定試驗(yàn)

圖1 黃芩提取物的紫外全波長掃描圖譜

3.2 黃芩提取物中總黃酮含量的測(cè)定

3.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

按既定試驗(yàn)方法，用紫外分光光度法對(duì)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：以吸光度（縱坐標(biāo)，）對(duì)質(zhì)量濃度（μg/mL，橫坐標(biāo)，）進(jìn)行線性回歸，回歸方程為＝0.079 8- 0.008 3（2＝0.999 7）。線性測(cè)定結(jié)果（如圖2所示）表明：在既定測(cè)定方法下，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液在質(zhì)量濃度2～10 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品系列溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.2.2 精密度試驗(yàn)

那日本兵又罵一聲八嘎，準(zhǔn)備再給周教授兩耳光。鬼子軍官揮手制止了。鬼子軍官背著手沿周教授走了一圈兒，又沿五個(gè)人走了一圈兒，最后面對(duì)著幾個(gè)站定，用生硬的中國話說，你們的，什么的干活？

2.3.4 黃芩提取物中總黃酮含量測(cè)定

按既定試驗(yàn)方法，系列蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液精密度測(cè)定結(jié)果如表1所示。表1表明，分別對(duì)低、中、高質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液連續(xù)重復(fù)5次測(cè)定，值均小于2%，表明本法的精密度良好。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

注：表中表示吸光度；表示標(biāo)準(zhǔn)偏差；表示相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差

按既定試驗(yàn)方法，對(duì)得到的黃芩提取物溶液進(jìn)行紫外全波長掃描，結(jié)果如圖1所示。掃描結(jié)果表明：黃芩提取物（10 μg/mL，按提取物質(zhì)量濃度計(jì)）在200～400 nm處具有較強(qiáng)的紫外吸收能力，在200 nm附近以及260 nm處均表現(xiàn)出較強(qiáng)的紫外吸收峰。

蘆丁對(duì)照品回收率測(cè)定結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，在既定測(cè)定方法下，低、中、高質(zhì)量濃度樣品回收率均大于95%，且平均回收率的值均小于2%，表明既定測(cè)定方法的回收率合格。

表2 加樣回收率測(cè)定結(jié)果

3.2.4 提取物中總黃酮含量測(cè)定

黃芩提取物中總黃酮含量測(cè)定結(jié)果表明，對(duì)中藥黃芩細(xì)粉進(jìn)行超聲提取，醇提物中總黃酮含量為20.41 mg/mL。

常愛蘭嫁到我們嶺北周村的第二年，麻糍就死了。麻糍死的第二年，常愛蘭又嫁了。常愛蘭嫁給馱子時(shí)，周小羽十歲。

3.3 自由基清除試驗(yàn)

3.3.1 羥基自由基（·OH）清除試驗(yàn)

婦幼保健檔案管理現(xiàn)代化水平的提高需要做好以下兩個(gè)方面工作:一方面,增強(qiáng)檔案管理人員技術(shù)水平,重視對(duì)新技術(shù)、新手段的應(yīng)用;另一方面,加大在婦幼保健檔案管理硬件方面投入力度,做好各項(xiàng)基礎(chǔ)設(shè)施建設(shè),提高先進(jìn)檔案管理技術(shù)應(yīng)用有效性,使檔案管理數(shù)字化和信息化水平得到有效提高。

按既定試驗(yàn)方法，研究不同質(zhì)量濃度的黃芩提取物體外清除·OH的效果，結(jié)果如表3所示。表3表明，在所設(shè)定的低、中、高質(zhì)量濃度下，黃芩提取物均具有清除·OH的效果，且清除效率具有劑量依賴性。隨著提取物質(zhì)量濃度的升高，黃芩提取物對(duì)于·OH的體外清除率也隨之升高。在提取物質(zhì)量濃度為100 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH的體外清除率接近80%。

表3 體外?OH清除試驗(yàn)結(jié)果

表4 體外O清除試驗(yàn)結(jié)果

3.4 體外菌體輻射試驗(yàn)

低、中、高質(zhì)量濃度的黃芩提取物對(duì)于菌體的抗輻射能力，如圖3所示。圖3表明：經(jīng)紫外輻射30 s后，空白對(duì)照組中大腸桿菌存活率約為20%，而加藥組中的存活量明顯升高，約為45%～75%，表明黃芩提取物具有抗紫外輻射作用，并且隨著提取物質(zhì)量濃度的升高，對(duì)菌體的保護(hù)作用增強(qiáng)。

21日上午，中國鐵路太原局集團(tuán)有限公司與山西省旅游發(fā)展委員會(huì)聯(lián)合主辦了“山西全域旅游鐵路行”推介會(huì)，啟動(dòng)“山西全域旅游鐵路行”，加快鐵路客運(yùn)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革，推動(dòng)山西全域旅游融合發(fā)展。

總而言之，寫作離不開實(shí)踐，教師若想提高學(xué)生的綜合寫作能力，一定不能操之過急，這是漫長的過程。在平時(shí)的教學(xué)中，教師應(yīng)培養(yǎng)學(xué)生用心感受生活，細(xì)致觀察生活中發(fā)生的小事情，從而有所感悟。學(xué)生也應(yīng)當(dāng)注重與周邊人相處時(shí)心靈的觸動(dòng)，同時(shí)教師也應(yīng)時(shí)常給予學(xué)生自信，激發(fā)學(xué)生對(duì)作文寫作的積極性，最后從根本上提升學(xué)生的綜合成績與閱讀水平。

圖3 體外菌體輻射保護(hù)試驗(yàn)

4 討論

在提取中藥黃酮類成分時(shí)，一般會(huì)使用滲漉法、回流法、超聲提取法、微波提取法等多種方法[13-15]。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[4]，本研究采用超聲提取法提取黃芩提取物，該法具有簡便易行的特點(diǎn)，可縮短提取時(shí)間，提高提取效率，同時(shí)，能避免高溫條件對(duì)于黃酮類有效成分的破壞。據(jù)前期研究結(jié)果可知，中藥藥材的粉碎粒度對(duì)其中有效成分的提取具有一定影響，藥材粉碎程度越大、粒度越小，更有助于提高有效成分的提取效率。因此，本研究中黃芩以細(xì)粉的形式進(jìn)行超聲提取。測(cè)定結(jié)果表明在該條件下，黃芩提取物中總黃酮類有效成分的含量較高。

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責(zé)任編輯：宗淑萍

Investigation of anti-ultraviolet radiation effect of extracts fromGeorgi

LI Na-kuna, WANG Xue-menga, LIU Li-yaoa,b, Corresponding Author, WANG Qing-kuib

（Tianjin Agricultural University, a. College of Basic Science, b. Tianjin Key Lab of Aquatic Ecology and Aquaculture, Tianjin 300384, China）

Flavonoids effective components, which possess anti-ultraviolet radiation effect through absorbing a broad spectrum of ultraviolet radiation and eliminating reactive oxygen species induced by ultraviolet radiation, are abundant in extracts from some Chinese medicine. Thus, in this investigation, ethanol extracts were acquired firstly through ultrasonic method and total flavonoid content was measured. On the basis of full wave scanning in ultraviolet area, absorptive effect of ultraviolet radiation was confirmed for ethanol extracts. Afterwards, eliminative effects of hydroxyl free radical and superoxide anion were studied andanti-ultraviolet experiments were established usingas model bacteria. Through this investigation, it was confirmed that ethanol extracts fromGeorgi do have anti-ultraviolet radiation effect and this effect is dose dependent.

Georgi extracts; anti-ultraviolet effect; elimination of free radicals;studies

1008-5394（2018）04-0063-05

10.19640/j.cnki.jtau.2018.04.014

P641.131；S152.72

A

2018-05-21

天津市教委科研計(jì)劃項(xiàng)目（2017KJ181）；天津市水產(chǎn)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目（ITTFRS2017004）

李娜坤（1996-），女，本科在讀，研究方向：中藥新劑型研究。E-mail: 784249285@qq.com。

劉黎瑤（1988-），女，講師，博士，主要從事藥物制劑方面的研究。E-mail: llymeilin@163.com。